The functional blood platelet and its biogenesis: Biochemical and cell biological analysis of thrombopoiesis in vitro, in situ and in vivo

Abstract

Blood platelets are essential in primary hemostasis preventing the body from blood loss by sealing injured vessels. During thrombopoiesis the platelet precursors, the MKs in BM form protrusions, designated as pro- and preplatelets, which penetrate vascularity and shed platelets into the peripheral blood stream. This process is dependent on a variety of cell- intrinsic and -extrinsic factors. The formation of proplatelets is the last step in the life of each MK and this differentiation step is highly dependent on the assembly of novel MT-filaments. MKs and platelets express the tissue- restricted β1- tubulin isoform. During activation the cortical MT coil contracts and therefore supports granule centralization prior to release. In a yeast-two-hybrid assay RanBP10 was identified as a new β1-tubulin interacting protein. Platelets from RanBP10 knock out mice show disordered MT bundling and reduced platelet reactivity. Mice harbor a severe bleeding phenotype despite normal platelet counts. In this context, three aspects have been analyzed: 1\. The impact of RanBP10 depletion in vivo was examined regarding MTequilibrium, platelet function and hemostasis. RanBP10-null platelets have a normal life time, are fully equipped with receptors and surface molecules and are not altered in adhesion potential under shear. In contrast, the thrombus stability in mutant mice is markedly impaired and shape change and the marginal band contraction are attenuated. However, dense granule secretion is not affected. In RanBP10 knock out mice more polymerized β1-tubulin is detected, thus it can be concluded that RanBP10 prevents premature MT polymerization in the presence of the MK/platelet-specific β1- tubulin isoform. 2\. A mouse model for the autoimmune disease immun Thrombocytopenia (ITP) was exploited to analyze and characterize the dynamic extrinsic processes of platelet biogenesis. A platelet depleting antibody was injected into mice to disrupt the homeostasis between MKs and platelets. The MK-population showed a dynamic reaction on platelet depletion. In vivo proliferation studies revealed, that newly formed MKs were generated from a pre-existing cell pool and were overall significantly smaller in size after depletion. The depletion antibody was still present on BM MKs for at least 5 days after application but antibody binding did not lead to apoptosis. For the first time in vivo, it has been shown by MPM that antibody decorated MKs are still able to form proplatelets. 3\. The in situ-characterization of the megakaryocytic BM niche was so far limited, due to harsh epitope-destroying decalcification steps on bone sections destroing epitopes for antibody staining. With the establishment of new histology methods an initial BM atlas regarding MK environment was developed. For the first time, in vitro generated data of putative niche- factors were revised in situ in complete murine femur sections. With further functional analyses, it is now possible to map the threedimensional topology not only of the megakaryocytic BM-niche environment. In total this work summarizes in vitro, in situ and in vivo analyses on cell-intrinsic and cell- extrinsic factors affecting platelet biogenesis.

Ein Gefäßverschluss zur Minimierung des Blutverlusts bei Verletzungen wird auf zellulärer Ebene von Blutplättchen (Thrombozyten) gewährleistet. Während der Thrombopoese schnüren sich neue Thrombozyten aus Megakaryozyten, den Vorläuferzellen im Knochenmark, in den peripheren Blutstrom ab. Für diesen Prozess müssen sowohl zell-intrinsische wie -extrinsische zellbiologische und biochemische Faktoren, ineinander greifen. Die Abschnürung von „Proplättchen“ aus Megakaryozyten während ihrer terminalen Differenzierungsphase ist ein von Mikrotubuli getriebener Prozess, wobei die heteropolymeren Mikrotubuli hier die β1-Tubulin-Isoform aufweisen, die spezifisch für Megakaryozyten ist. Der kortikal Mikrotubuli-Ring unterstützt nach Aktivierung die Granula Zentralisierung und verstärkt damit die Plättchen Aktivierung. In einem Hefe-2 -Hybrid-Experiment wurde RanBP10 als ein neuer β1-Tubulin- Bindungspartner identifiziert. Plättchen aus RanBP10 knock-out Mäusen zeigen eine ungeordnete Mikrotubulibündelung und einen Blutungsdefekt. Außerdem ist ein deutlicher Defekt in der Hämostase trotz normaler Thrombozytenzahlen beobachtbar. In der vorliegenden Arbeit wurden drei Aspekte der Biogenese funktionaler Thombozyten untersucht: 1\. Die RanBP10-Protein Depletion wurde hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf Mikrotubuli-Gleichgewicht, Plättchenfunktion und Hämostase untersucht. Es wurde Zusammenfassung gezeigt, dass Thrombozyten, trotz RanBP10-Depletion, die volle Rezeptorvielfalt exprimieren und nicht in ihrer Lebensdauer und nur wenig in ihrer Fähigkeit unter Scherkräften zu adhärieren beeinträchtigt sind. Es konnte in vivo gezeigt werden, dass die Thrombusstabilität in RanBP10-null Mäusen stark gestört ist. Trotz einer verzögerten Kontraktion des Mikrotubuli-Rings und der damit verlangsamten Zentralisierung der Granula ist deren Sekretion in den transgenen Tieren nur wenig beeinträchtig. In RanBP10-knock out Tieren liegt im Vergleich zum Wildtyp mehr β1- Tubulin in polymerisierter Form vor und RanBP10 verhindert ein verfrühtes polymerisieren von Mikrotubuli. 2\. Es wurde ein Mausmodell der Autoimmunerkrankung Immunthrombozytopenie (ITP) verwendet, um zell- extrinsische Faktoren, die die Biogenese von Thrombozyten beeinflussen, weiter zu charakterisieren. Es wurde ein Plättchen-depletierender Antikörper in Mäuse injiziert und somit Megakaryopoese stimuliert. In vivo Proliferations- Untersuchungen ergaben, dass die neugeblideten Zellen aus einem schon vorhandenen Zellpool generiert werden und signifikant kleiner sind. Des Weiteren kann der injizierte Antikörper noch fünf Tage nach Injektion auf Megakaryozyten nachgewiesen werden, ohne zur Apoptose führt. Es wurde mittels 2-Photonen- Mikroskopie zum ersten mal in vivo gezeigt, dass Antikörper- dekorierte Megakaryozyten weiterhin zu Proplättchenbildung in der Lage sind. 3\. Die in situ Charakterisierung der megakaryozytären Knochenmarknische mittels spezifischer Antikörper konnte in Vergangenheit auf Grund harscher Epitopzerstörender Decalzifizierungsschritte nur unzureichend durchgeführt werden. Mit der Etablierung neuer histologischer Methoden konnte begonnen werden, einen Atlas der megakaryozytären Knochenmarksnische zu erstellen. Dies ermöglicht zum ersten mal, die in vitro generierten Daten von potentiellen Nischenfaktoren, in situ in komplett erhaltendem Knochenschnitten, zu überprüfen. Mittels weiterführender funktionaler Studien ist es dann möglich, die dreidimensionale Topologie nicht nur der megakaryozytären Knochenmarksumgebung zu entschlüsseln. Diese Arbeit umfasst in vitro, in situ und in vivo Analysen zell-intrinsischer und zellextrinsischer Faktoren die maßgeblich an der Plättchenbiogenese beteiligt sind.