Auswirkung verschiedener Methioninsupplemente auf den Aminosäuretransport, das Metabolom und den Entzündungsstatus im Dünndarmepithel des Schweins

Abstract

Eine Aminosäure (AS) mit besonderer Relevanz für die Schweinefütterung ist Methionin (Met), welche in Form von DL-Met, L-Met oder DL-2-Hydroxy-4-(methylthio)buttersäure (DL-HMTBA) supplementiert werden kann. Es ist bekannt, dass diese Met-Supplemente den intestinalen Transport von Met sowie den Met-Metabolismus beeinflussen können. Die vorliegende Arbeit zielte darauf ab, die folgenden Hypothesen zu prüfen: Erstens, dass die Art des Met-Supplements nicht nur den Met-Transport, sondern auch den Transport weiterer AS beeinflusst und zweitens, dass sich verschiedene Met-Supplemente unterschiedlich auf das epitheliale Metabolom sowie die Expression von inflammatorischen Markern im porzinen Dünndarm auswirken. Im ersten Teil des Projektes wurde entweder eine Diät mit DL-Met, L-Met, DL-HMTBA oder keinem zusätzlichen Met-Supplement an junge Mastschweine verfüttert. Ihr Jejunum wurde verwendet, um den mukoserosalen Flux von [14C]-markiertem L-Glutamin, Glycin, LLeucin, L-Lysin, L-Met, L-Serin, L-Threonin, L-Tryptophan, L-Tyrosin und L-Valin mittels eines Ussing-Kammer-Modells zu untersuchen. Alle Fluxuntersuchungen wurde in An- und Abwesenheit von mukosalem Na+, sowie zwei mukosalen AS-Konzentrationen (50 μM/5 mM) durchgeführt. Weiterhin wurde eine Korrelationsanalyse der Na+-abhängigen AS-Fluxe angefertigt, sowie die cis-Inhibition des apikalen Transports durch mukosales L-Met untersucht. Für letzteres wurde ausschließlich eine DL-Met-Vorfütterung eingesetzt. Um funktionelle Unterschiede zwischen der vorliegenden und einer vorangegangenen Studie zu untersuchen, wurde die jejunale Genexpression neutraler apikaler AS-Transporter (SLC1A5, SLC6A19, SLC6A20, SLC6A14) sowie verschiedener Entzündungsmarker (NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3), Caspase1 (CASP1), Interleukin (IL)1β, IL8, IL18, Tumornekrosefaktor α, Transforming growth factor β (TGFβ)) und des Angiotensin-Konversionsenzyms II (ACE2) zwischen beiden Studien verglichen. Die Ergebnisse zeigten eine deutliche Na+-Abhängigkeit fast aller AS-Fluxe mit Ausnahme von Lysin und Tryptophan bei 5 mM AS-Konzentration. Diese Na+-abhängigen Fluxe korrelierten vielfach untereinander. Ausnahmen bildeten Glycin mit nur wenigen und Tryptophan mit keiner Korrelation zu weiteren AS. Die apikale Aufnahme aller AS außer Glycin und Lysin war einer cis-Inhibition durch mukosales Met unterworfen. Die vergleichenden Untersuchungen der Genexpression zeigte eine erhöhte Expression von SLC6A19 (B0AT1) und eine niedrigere Expression von SLC6A14 (ABT0,+) in der vorliegenden vs. der Vorgängerstudie. Zusätzlich konnte eine erhöhte Expression aller Entzündungsmarker außer NLRP3 und IL18 in der Vorgängerstudie nachgewiesen werden. Die Expression des Angiotensin-Konversionsenzyms II unterschied sich nicht signifikant zwischen den beiden Studien.

Im zweiten Teil des Projektes wurde das Metabolom des Duodenums, des proximalen und mittleren Jejunums sowie des Ileums von Schweinen mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie und Tandemmassenspektrometrie analysiert. Die Tiere erhielten entweder DL-Met, L-Met oder DL-HMTBA als Futtersupplemente. Weiterhin wurde dieses Gewebe verwendet, um den Einfluss der Supplemente auf die Expression verschiedener Entzündungsmarker (NLRP3, CASP1, IL1β, IL8, IL18, TGFβ) zu untersuchen. Die Supplemente hatten keine Auswirkung auf das globale intestinale Metabolom, allerdings zeigte eine Stoffwechselweg-Analyse einen signifikanten Effekt auf Stoffwechselwege des Lipidmetabolismus. So reduzierte L-Met die relative Konzentration von mehrfach ungesättigten Fettsäuren im Gewebe. Weiterhin waren sekundäre Gallensäuren im Jejunum der L-Met- und im Ileum in der DL-HMTBA-Gruppe angereichert. Im distalen Dünndarm zeigte sich eine signifikante Anreicherung von Monohydroxy-Fettsäuren sowie ein statistischer Trend in Richtung Anreicherung von Sphingosinen. Hingegen hatten die Supplemente eine weniger deutliche Auswirkung auf Metabolite, die mit dem antioxidativen System und dem inflammatorischen Status in Verbindung stehen. So führte insbesondere L- und DL-Met-Supplementierung zu einer Anreicherung einzelner oxidierter Met-Metabolite im Gewebe. Zusätzlich wurde ein statistischer Trend der Anreicherung von Metaboliten im Tocopherol- und im Histidin-Metabolismus beobachtet. Hierbei ging eine DL-Met- und DL-HMTBA-Supplementierung mit einem relativen jejunalen Anstieg von β- und γ-Tocopherolen sowie von α-Tocotrienolen im Gewebe einher. Zusätzlich waren Histidinmetabolite in der DL-Met-Gruppe angereichert. Die Expressionslevel der Entzündungsmarker unterschieden sich in dieser Studie nicht zwischen den Met-Supplementen. Zusammenfassend hatte die Met-Supplementierung in dieser Arbeit keine Auswirkung auf den intestinalen AS-Transport. Allgemein unterstützen die Daten jedoch das gegenwärtige Konzept des intestinalen neutralen AS-Transportes, welches B0AT1 eine prominente Rolle zuschreibt. Im intestinalen Metabolom beeinflussten die Met-Supplemente verschiedene Lipid-Stoffwechselwege, die Expression von Entzündungsmarkern unterschied sich in der vorliegenden Studie allerdings nicht zwischen den Met-Supplementen. Jedoch sprechen die Expressionsunterschiede der Entzündungsmarker zwischen den Studien dafür, dass die Effekte von Met-Supplementen auf den AS-Transport durch sekundäre Faktoren wie beispielsweise eine Entzündung beeinflusst werden können. Die vorliegende Arbeit zeigt praxisrelevante Aspekte der Met-Supplementierung auf und legt damit die Basis für zukünftige Studien zur detaillierten Charakterisierung des Einflusses externer Faktoren auf die Interaktion zwischen Met-Supplementen und dem AS-Transport sowie der Regulationsmechanismen von Met-Supplementierung im intestinalen Lipidmetabolismus.

An amino acid (AA) with special relevance for porcine nutrition is methionine (Met), which can be supplemented in form of DL-Met, L-Met or DL-2-hydroxy-4-(methylthio)butyric acid (DL-HMTBA). It is known that these supplements influence the intestinal transport and metabolism of Met. The present thesis aimed to test the following hypotheses: Firstly, that the type of Met-supplement influences the transport of AA other than Met and secondly, that they affect the epithelial metabolome and the expression of inflammation-related markers in the small intestine of pigs. In the first part of the project, either DL-Met, L-Met, DL-HMTBA or no Met supplement was fed to young grower pigs. Their jejunum was used to investigate the mucosal-to-serosal flux of [14C]-labeled L-glutamine, glycine, L-leucine, L-lysine, L-Met, L-serine, L-threonine, Ltryptophan, L-tyrosine and L-valine in an Ussing chamber model. All flux measurements were performed in the presence and absence of mucosal Na+, as well as two mucosal AA concentrations (50 μM/5 mM). Additionally, a correlation analysis of the Na+-dependent fluxes was executed and the cis-inhibition of apical AA uptake by L-Met was tested. The latter was performed only after dietary DL-Met supplementation. In order to elucidate differences in functional data between a preceding and the present study, the jejunal gene expression of neutral AA transporters (SLC1A5, SLC6A19, SLC6A20, SLC6A14), of different inflammation-related markers (NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3), caspase1 (CASP1), interleukin (IL)1β, IL8, IL18, tumor necrosis factor α (TNFα), transforming growth factor β (TGFβ)) and of the angiotensin converting enzyme II was compared between both studies. The results showed a distinct Na+-dependency of almost all AA fluxes, except for lysine and tryptophan at 5 mM AA concentration. These Na+-dependent fluxes exhibited multiple correlations among each other. Exceptions were glycin with only few and tryptophan with no correlations to other AA. The apical uptake of all AA but lysine and glycine were subject to cis-inhibition by mucosal Met. The comparative analysis of gene expression showed a higher expression of SLC6A19 (B0AT1) and a lower expression of SLC6A14 (ATB0,+) in the present vs. the preceding study. Additionally, an increased expression of all inflammation-related markers except NLRP3 and IL18 was shown in the preceding study. The expression of the angiotensin converting enzyme II did not differ significantly between the two studies. In the second part of the project, the metabolome of duodenum, proximal and middle jejunum as well as the ileum of pigs was investigated by ultrahigh performance liquid chromatography and tandem mass spectroscopy. The animals received either DL-Met, L-Met or DL-HMTBA as dietary supplements. Additionally, their tissue was used to investigate the expression of different inflammatory markers (NLRP3, CASP1, IL1β, IL8, IL18, TGFβ). The supplements did not influence the global intestinal metabolome, but a pathway analysis revealed a significant effect on distinct pathways of the lipid metabolism. Thus, L-Met reduced the relative concentration of polyunsaturated fatty acids in the tissue. Furthermore, secondary bile acids accumulated in the jejunum of the L-Met and in the ileum of the DL-HMTBA group. In the distal jejunum a significant enrichment of monohydroxy fatty acids, as well as a statistical trend towards the enrichment of sphingosines was observed. However, the supplements had a more subtle effect on the metabolites related to the antioxidative and inflammatory status. L-Methionine and DL-Met supplementation in particular led to the accumulation of individual oxidated Met metabolites within the tissue. Besides, Met-supplementation resulted in a trend towards metabolite enrichment in the tocopherol- and histidine-metabolism. In detail, DL-Methionine- and DL-HMTBA-supplementation was accompanied by a relative increase of β- and γ-tocopherols, as well as α-tocotrienols in the tissue. Additionally, histidine metabolites were enriched in the DL-Met group. The expression of inflammation-related markers did not differ between the supplementary groups. In conclusion, the Met supplements did not influence the intestinal AA transport in this study. In general, however, the data support the current concept of intestinal neutral AA transport, ascribing a prominent role to B0AT1. Within the intestinal metabolome, different lipid pathways were affected by the Met supplements while the expression of inflammation-related markers did not differ between Met supplements. However, the differences in expression of inflammation-related markers between the studies indicate that the effects of Met supplements on the AA transport may be influenced by secondary factors. The present thesis lays the foundation for future studies elucidating the effect of external factors on the interaction between Met supplements and the AA transport as well as the regulatory mechanisms of Met supplementation on the intestinal lipid metabolism in detail.