Structure and activity of the human glycogen debranching enzyme

Abstract

The human glycogen debranching enzyme (GDE) is central in the degradation of glycogen, the storage of glucose in biological organisms. While glycogen phosphorylase partially degrades glycogen particles, GDE acts as a bifunctional protein with 4-⍺-glucanotransferase and amylo-⍺-1,6-glucosidase activities, catalysing the removal of the ⍺(1-6)-linked branches, to promote the efficient mobilisation of glucose, our metabolic fuel. Dysfunctional GDE leads to a rare genetic disease, the glycogen storage disease type III, for which treatment options are limited. While the function of GDE has been investigated in rabbit and yeasts, studies focusing on the human GDE are scarce, hindering a molecular understanding of its properties.

Here, a recombinant platform for the expression and purification of stable and folded human GDE was established in Escherichia coli, adapting and optimising previously published protocols. GDE is active in vitro on three different carbohydrate substrates, which were used to measure its two catalytic activities independently and the combined debranching activity. The experimental structure of human GDE was determined by cryogenic electron microscopy to high resolution that allowed the accurate design of protein variants, encoding single domains or combination of domains (deletions). These deletions are inactive on all substrates, indicating that functional interdependence between the domains exists. Moreover, monofunctional mutants of GDE, possessing only one of its two enzymatic activities, were produced to verify whether an advantage of catalytic bifunctionality can be observed. Contrary to the characterised fungal homolog, the colocalisation of the two activities in a single bifunctional protein promotes the fast degradation of glycogen and the release of glucose.

The structure of GDE now allows to investigate the effect of uncharacterised mutations and the relevance of inter-domain interactions with biochemical and biophysical assays. Furthermore, studies of substrate-enzyme complexes and detailed kinetic analyses of GDE activity will help elucidate carbohydrate-binding sites and the roles of the putatively noncatalytic domains, in particular regarding substrate channeling.

Das menschliche Glykogenentzwiegungsenzym (GDE) ist ein wichtiges Protein für den effizienten Abbau von Glykogen, dem Speicher von Glukose in biologischen Organismen. Nach der Glykogenphosphorylase, die die Glykogenpartikel teilweise abbaut, fungiert GDE als bifunktionelles Protein mit 4-⍺-Glucanotransferase und Amylo-⍺-1,6-Glucosidase Aktivität welche die Spaltung der ⍺(1-6)- Verzweigungen katalysiert um Glukose, unseren Stoffwechselbrennstoff, effizient zu mobilisieren. Funktionsgestörtes GDE ist die Ursache der Typ III-Glykogen-Speicherkrankheit, einer seltenen genetischen Erkrankung mit wenigen Behandlungsoptionen. Während die Funktion der GDE in Kaninchen und Hefen untersucht wurde, gibt es nur wenige Studien, die sich auf die menschliche GDE konzentrieren, was ein molekulares Verständnis ihrer Eigenschaften aufhielt.

Hier wurde eine rekombinante Plattform für die Expression und Reinigung von stabiler, korrekt gefalteter und aktiver menschlicher GDE in Escherichia coli etabliert. Die zwei katalytischen Aktivitäten von GDE und seine kombinierte Entzweigungsaktivität wurden in vitro auf drei verschiedenen Substraten gemessen. Die Aufklärung der experimentellen Struktur der menschlichen GDE mittels Kryoelektronenmikroskopie zu hoher Auflösung, ermöglichte die strukturbasierte Konstruktion von Proteinvarianten, die für einzelne Domänen oder Kombinationen von Domänen (Deletionen) kodieren. Diese Deletionen sind für alle Substrate inaktiv, was darauf hindeutet, dass zwischen den Domänen eine funktionelle gegenseitige Abhängigkeit besteht. Außerdem wurden monofunktionelle Mutanten der GDE hergestellt, die nur eine der beiden enzymatischen Aktivitäten besitzen, um zu überprüfen, ob ein Vorteil Bifunktionalität zu beobachten ist. Entgegen den Beobachtungen bei fungalen Homologen, fördert die Kolokalisierung der beiden Aktivitäten in einem einzigen bifunktionellen Protein den schnellen Abbau von Glykogen und die Freisetzung von Glukose.

Die Struktur von GDE ermöglicht es jetzt, die Auswirkungen von nicht charakterisierten Mutationen und die Bedeutung von Interdomänen-Interaktionen mit biochemischen und biophysikalischen Assays zu untersuchen. Außerdem, werden Untersuchungen von Substrat-Enzym-Komplexen und detaillierte kinetische Analysen der GDE-Aktivität dazu beitragen, die Kohlenhydratbindestellen und die Rolle der vermeintlich nichtkatalytischen Domänen zu klären, insbesondere bezüglich der Metabolit-Kanalisierung.