The use of antisenseoligonucleotides to study MCM function during the initiation of DNA replication

Abstract

The work presented in this thesis determined the effects on targeted down regulation of a vital gene product involved in the intiation of DNA synthesis in nontransformed cells. MCM4 protein, a member of a heterohexameric MCM complex with a proposed DNA helicase activity was targeted by antisense oligonucleotides in primary human cell line. It was found that targeted downregulation of MCM4 resulted in degradation of the remaining MCM complex proteins with a rapid and specific kinetic. This is a novel finding. Downregulation of MCM4 protein, solubilizes chromatin bound MCM protein complexes resulting in a block of DNA synthesis. Additionally, cells lacking MCM complexes exhibit drastically extended population doubling times resulting in a virtually complete proliferative block. Cells enriched in G1 phase by withdrawal of mitogenic stimulation fail to enter S-phase upon restimulation in the absence of MCM complex. In addition to contributing substantative data for the function of MCM proteins, these results should provide a reference for further studies in primary human cells of the inititation of DNA replication.

Die in der vorliegenden Arbeit erstellten Experimente beschreiben Effekte, die durch das kontrollierte Abschalten eines für die Initiation der DNA- Replikation essentiellen Gens in nicht transformierten humanen Zellen hervorgerufen wurden. Das Protein MCM4, Mitglied des heterohexameren MCM- Komplexes mit einer putativen DNA-Helicase-Aktivität, wurde durch Antisense- Technologien in primären humanen Lungenfibroblasten ausgeschaltet. Dieses Phänomen wurde sowohl auf mRNA als auch auf Proteinebene bestätigt. Es konnte erfolgreich gezeigt werden, dass die Abwesenheit von MCM4 zur Degradation anderer Protein des MCM-Komplexes führt. Dieser Prozess läuft mit schneller Kinetik ab. Hierbei handelt es sich um eine bis dahin nicht publizierte Beobachtung. Abschalten des MCM4 löst den Chromatin gebundenen MCM-Komplex auf, Woraus eine Blockade der DNA-Synthese resultiert. Zusätzlich zeigen Zellen ohne MCM-Komplex drastisch verlängerte Verdopplungszeiten, was praktisch zu einer kompletten Proliferationsblockade führt. Der exakte Punkt, an dem die Zellzyklusblockade stattfindet, konnte im Rahmen dieser Arbeit bestimmt werden. Zellen, die durch den Entzug eines mitogenen Stimulus in der GO-Phase arretiert wurden, Können ohne Neubildung eines Funktionellen MCM Komplexes die Proliferation nicht wieder aufnehmen. Zusätzlich zum Beitrag dieser Arbeit zur Klärung einiger essentieller Funktionen der MCM-Proteine können diese Resultate eine Basis für weitere Studien zur Initiation der DNA- Replikation in primären humanen Zellen liefern. Dies ist besonders für medizinische Aspekte, in denen die MCM-Proteine mögliche Angriffspunkte in der Behandlung von Krebserkrankungen darstellen könnten, von großem Interesse.