Microbial rhodopsins, retinal-binding transmembrane photoreceptors, mediate diverse cellular functions including ion transport, photosensing and enzymatic activity during a photocycle. This thesis investigates three distinct proton-transporting rhodopsins: UmRh1 from a plant pathogenic fungus (outward proton pump, potentially a pathogenicity factor), NsXeR from marine bacteria (inward proton pump, function unknown), and CaChR1 from algae (cation channel involved in phototaxis). Extensive site-directed mutagenesis was applied to putative residues involved in the proton transfer of UmRh1 and NsXeR. The M state in the photocycle course, initiated by proton release from the retinal Schiff base, and the protein-bulk interfacial proton transfer were probed using time-resolved UV/Vis spectroscopy (flash photolysis). Applied infrared spectroscopy revealed the specific hydrogen bonding interactions and protonation states of the assigned residues, providing insights into their local chemical environment. For UmRh1, the results indicate distinct features compared to previously studied outward proton pumps, including a distinct extracellular proton-releasing group, direct proton uptake from the cytoplasm to retinal Schiff base (despite an evolutionarily conserved internal proton donor), and the effect from weak organic acids, including the plant hormone auxin (IAA), on the photoreaction. In NsXeR, an early proton release at the cytoplasmic cavity was observed in the photocyclic L to M state transition, analogous to the outward proton pumps but here in the opposite direction. The results of mutagenesis and subsequent spectroscopies shed light on the unique proton uptake pathway and charge distribution within the retinal binding pocket of NsXeR, as these are the main characteristics that distinguish inward proton pumps from outward proton pumps. Furthermore, the influence of cysteine protonation on protein function is illustrated and discussed, drawing upon site-directed mutagenesis of UmRh1 and NsXeR, and structural interpretations from the cryo-EM resolved CaChR1 dimeric structure. Collectively, this thesis provides detailed mechanistic insights into the proton transfer processes of outward and inward proton pumps as well as a cation channel, showing that proton dynamics play an important role in protein activity.
Mikrobielle Rhodopsine sind Retinal-bindende, membrandurchspannende Photorezeptoren, die vielfältige zelluläre Funktionen, darunter Ionentransport, Photosensorik und enzymatische Aktivität vermitteln. In dieser Dissertation werden drei verschiedene Protonen transportierende Rhodopsine untersucht: UmRh1 aus einem pflanzenpathogenen Pilz (nach außen gerichtete Protonenpumpe, potenziell ein Pathogenitätsfaktor), NsXeR aus marinen Bakterien (nach innen gerichtete Protonenpumpe, Funktion unbekannt) und CaChR1 aus Algen (Kationenkanal, der an der Phototaxis beteiligt ist). Zum Zwecke der funktionellen und spektroskopischen Untersuchung von Aminosäuren, die möglicherweise am Protonentransport in UmRh1 und NsXeR beteiligt sind, wurden ortsspezifische Mutagenesen durchgeführt. Der durch die Protonenfreisetzung von der retinalen Schiff’schen Base initiierte M-Zustand des Photozyklus sowie die Protein-Umgebungs-Grenzfläche wurden mittels zeitaufgelöster UV/Vis-Spektroskopie (Blitzlichtphotolyse) untersucht. Die angewandte IR-Spektroskopie enthüllte die spezifischen Wasserstoffbrückenbindungs-interaktionen und Protonierungszustände der zugeordneten Aminosäuren und lieferte Einblicke in ihre lokale chemische Umgebung. Für UmRh1 deuten die Ergebnisse auf deutliche Unterschiede zu zuvor untersuchten nach außen gerichteten Protonenpumpen hin. Diese Unterschiede beinhalten eine besondere extrazelluläre protonenfreisetzende Gruppe sowie eine direkte Protonenaufnahme vom Zytoplasma zur retinalen Schiff’schen Base (obwohl ein evolutionär konservierter interner Protonendonor potentiell vorhanden wäre). Desweiteren zeigten schwache organische Säuren, einschließlich des Pflanzenhormons Auxin (IAA), Einfluss auf die Photoreaktion. Bei NsXeR wurde eine frühe Protonenfreisetzung im zytoplasmatischen Hohlraum während des photozyklischen L zum M Zustandsübergang beobachtet, analog zu nach außen gerichteten Protonenpumpen, jedoch in entgegengesetzter Richtung. Mutagenese und nachfolgende spektroskopische Analysen werfen Licht auf den einzigartigen Protonenaufnahmeweg und die Ladungsverteilung innerhalb der retinalen Bindungstasche von NsXeR und unterstreichen die wichtigsten Charakteristika, die die nach innen gerichteten von nach außen gerichteten Protonenpumpen unterscheiden. Darüber hinaus wird der Einfluss der Protonierung von Cysteinen auf die Proteinfunktion veranschaulicht und diskutiert, wobei auf die ortsspezifische Mutagenese von UmRh1 und NsXeR sowie auf eine strukturelle Interpretation der mit kryo-EM aufgelösten dimeren Struktur von CaChR1 zurückgegriffen wird. Zusammenfassend liefert diese Dissertation detaillierte mechanistische Einblicke in die Protonentransfer-prozesse von nach außen und nach innen gerichteten Protonenpumpen sowie eines Kationenkanals und demonstriert die entscheidende Rolle der Protonendynamik für die Proteinaktivität.
