Charakterisierung des N-Glykosylierungsprofils der neuen Entenzelllinie AGE1.CR und die gerichtete Modifikation der Fucosylierung

Abstract

In der vorliegenden Dissertation wurden die N-Glykosylierungseigenschaften der neuen Designerzelllinie AGE1.CR charakterisiert. Die Zelllinie wurde aus Retinazellen der Ente Cairina moschata über die Expression adenoviraler Proteine immortalisiert. Durch die zusätzliche Expression des adenoviralen pIX-Proteins wurden in der AGE1.CR veränderte biochemische Eigenschaften beobachtet, die sich möglicherweise auf einen konstitutiv aktivierten Heat- Shock rückführen lassen. Dazu zählen Wachstumsunterschiede und eine verstärkte Virusproduktivität. Da diese einen Einfluss auf die Glykosylierung haben könnten, wurde die N-Glykosylierung beider Entenzelllinien, AGE1.CR und AGE1.CR.pIX, untersucht. In Hinblick auf die funktionelle Relevanz von N-Glykanen wurde insbesondere die zellspezifische Sialylierung und Fucosylierung der Zellmembran-glykoproteine und rekombinant exprimierter Proteine mittels Lektinfärbung, Chromatographie und Massenspektrometrie analysiert. Über RP-HPLC konnte für die AGE1.CR- und AGE1.CR.pIX-Zelllinien die ausschließliche Expression von Neu5Ac statt der bei tierischen Zellen häufig auftretenden Neu5Gc nachgewiesen werden. Mittels spezifischer Lektine konnte der Verknüpfungstyp der Neu5Ac beider Entenzelllinien als a2-3- und a2-6-glykosidisch bestimmt werden. Im Gegensatz zur häufig verwendeten Produktionszelllinie Chinese Hamster Ovary (CHO), welche ausschließlich a2-3-verknüpfte Neu5Ac aufweist, eignen sich die Entenzelllinien somit insbesondere zur Produktion von anti-inflammatorischen rekombinanten IgGs (rek.IgG). Die Zellmembranglykosylierung wies überwiegend triantennäre komplexe N-Glykane auf. Somit exprimieren die Entenzelllinien, ähnlich zur humanen neuronalen Zelllinie (AGE1.HN, ProBioGen), höherantennäre komplexe N-Glykane, im Vergleich zur CHO-Zelllinie mit überwiegend biantennären Strukturen. Der Fucosylierungsgrad konnte chromatographisch und massenspektrometrisch anhand von Membranglykoproteinen nachgewiesen werden. Hierbei zeigten sich die Entenzelllinien überwiegend einfach-fucosyliert mit einem insgesamt geringeren Fucosylierungsgrad als die CHO-Zelllinie. Im Gegensatz zu Membranglykoproteinen wiesen die rek.IgGs aus beiden Entenzelllinien einen für IgG typischen hohen Anteil an Core-Fucose auf. Im Weiteren ließ sich für beide Entenzelllinien im Vergleich zur CHO-Zelllinie, sowohl für Membranglykoproteine als auch für rek.IgG, eine geringere Galactosylierung messen. Die AGE1.CR.pIX Zelllinie wies im Vergleich zur AGE1 .CR-Zelllinie v.a. eine höhere Galactosylierung auf. Dies könnte in der Aktivierung von Heat-Schock-Proteinen durch das pIX-Protein begründet sein, was mit einer strengeren Kontrolle der Proteinfaltung einhergeht. Da die Proteinglykosylierung für eine korrekte Proteinfaltung entscheidend sein kann, ist eine vollständigere Galactosylierung bei der AGE1.CR.pIX-Zelllinie im Vergleich zur AGE1.CR-Zelllinie plausibel. Anhand des rek.IgGs konnte über eine Kombination verschiedener Analysemethoden die Eigenschaft der Entenzelllinien zur Ausbildung der Bisecting-Struktur nachgewiesen werden. Diese Struktur ndet sich ebenfalls häufig in IgG, welches aus humanem Serum isoliert wurde, nicht aber in rek.IgG aus der CHO-Zelllinie. Für rek.IgG, exprimiert in den Entenzellinien, und Anti-HER2/neu (Trastuzumab), exprimiert in der CHO-Zelllinie, konnte erfolgreich eine neue Strategie zur Fucosereduktion mit gesteigerter Fc-Effektorfunktion durchgeführt werden. Die Methode inhibiert den Neusyntheseweg der GDP-Fucose und stellt eine Alternative zu derzeitig verfügbaren Strategien, wie der Expressionsreduktion der FUT8, dar und ermöglicht die Generierung stabiler Zelllinien mit nahezu vollständig inhibierter Fucosylierung. In den Entenzelllinien, welche insbesondere zur Virusproduktion geeignet sind, wurde weiterhin der Virus Modified Vaccinia Virus Ankara (MVA) produziert und dessen N-Glykosylierung massenspektrometrisch untersucht. Die N-Glykosylierung der MVA-Partikel zeigte sich erwartungsgemäß wirtsähnlich. MVA-Partikel und Membranglykoproteine nach Infektion wiesen jedoch überraschenderweise, im Vergleich zu Membranglykoproteinen ohne Infektion, eine erhöhte Sialylierung auf. Es wird vermutet, dass MVA-Partikel mit gesteigerter Sialylierung längere Serumhalblebenszeiten aufweisen und sich eventuell mit höherer Affinität an die Wirtszelloberfläche anheften. Diese Arbeit wirft die Frage auf, ob MVA diese Eigenschaft gezielt hervorrufen kann. In Zukunft könnte dies beispielsweise anhand von Experimenten mit weiteren Zelllinien näher untersucht werden. Anhand der untersuchten Zellmembranglykosylierung und der Glykosylierung des rek.IgGs konnten erfolgreich spezifische Glykosylierungseigenschaften der Entenzelllinien nachgewiesen werden. Hierzu zählen die Ausbildung überwiegend komplexer N-Glykane, die Fähigkeit zur Ausbildung der Bisecting-Struktur, sowie die Ausbildung der Core-Fucose und der Sialylierung mit ausschließlich Neu5Ac in a2-3- und a2-6-Verknüpfung. Es konnten zudem keine für den Menschen potentiell immunogenen Monosaccharide (z.B. Xylose oder Neu5Gc) oder Oligosaccharide (z.B. ausschließlich mannosereiche Strukturen) identifiziert werden. Die Entenzelllinien bilden somit eine human-ähnliche Glykosylierung aus und sind aufgrund dessen nicht nur geeignet zur Produktion von Viren, sondern auch von rekombinanten therapeutischen Proteinen für den Menschen.

In the present dissertation the N-glycosylation profile of a new avian cell line, AGE1.CR, has been characterised. This cell line has been developed from retina cells of the Muscovy duck (Cairina moschata) by immortalization via stable transfection with E1 genes from human adenovirus type 5 and was designed by ProBioGen AG to replace primary chicken cells in the eld of vaccine production. AGE1.CR.pIX is a modified CR cell line transfected for stable expression of the pIX-gene that encodes a structural protein of human adenovirus type 5. This modification further increases productivity of the cell line for certain viral vectors. However the AGE1.CR.pIX cell line showed an increased glucose consumption and propensity to cell-cell aggregation. Given that cell contacts and glycosylation are closely related, the N-glycosylation profile of both avian cell lines - AGE1.CR and AGE1.CR.pIX - was characterised. With regard to functionality the focus of the characterisation was on cell-specific sialylation and fucosylation. In addition, native cell membrane glycoproteins and recombinant glycoproteins were analysed by specific lectin staining, chromatography and mass spectrometry. Sole expression of N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac) instead of typical N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc) was determined by RP-HPLC for the AGE1.CR- and AGE1.CR.pIX cell line as in human cells. Surprisingly, specific lectin staining coupled with FACS-analysis showed an a2-3- and a2-6-glykosidic linked Neu5Ac for avian cell lines. In comparison, the common used producer cell line chinese hamster ovary (CHO) exclusively expresses a2-3-linked Neu5Ac. Due to the ability of expressing a2-6-linked Neu5Ac the avian cell lines are useful to produce anti-inflammatory recombinant human IgGs (rec.IgG). The analysed N-glycosylation profile of avian cell membrane glycoproteins exhibited predominantly complex type tri-antennary N-glycans. Similar to the analysed human neuronal cell line (AGE1.HN, ProBioGen), avian cells showed a higher antennary composition in contrast to the CHO cell line with predominantly complex type bi-antennary N-glycans. By chromatography and mass spectrometry, a decreased fucosylation state could be determined for avian cell membrane glycoproteins in contrast to CHO. Complex type N-glycans were found to be predominantly single fucosylated in the a1-6-linked state also known as core-fucose. In contrast to a decreased fucosylation state of avian cell membrane glycoproteins rec.IgG was produced with a IgG-typical high core-fucosylation. Furthermore, in comparison of avian and CHO cell lines avian cell membrane glycoproteins and rec.IgGs showed a decreased galactosylation state. The AGE1.CR showed further a decreased galactosylation state in contrast to the AGE1.CR.pIX cell line, as the only detected diference in between of the two avian N-glycosylation profiles. Because galactosylation is one of the final processing steps of well-folded proteins this supports the model where pIX in the AGE1.CR.pIX activates heat shock responses that potentially improve protein folding and maturation. It is also demonstrated that the avian cells, as opposed to CHO, express rec.IgG with bisecting GlcNAc structures similar to IgG in human serum. Furthermore a new strategy for stable reduction of fucosylation was successfully implemented in avian and CHO cell lines expressing rec.IgG. This method inhibits the de novo synthesis of GDP-Fucose and demonstrates a novel alternative to common stategies such as the a1-6-fucosyltransferase (FUT8) -knockout. rec.IgG with demonstrated reduction in fucosylation showed an increased Fc-mediated effector function. The avian cell lines, were further used to produce the modified vaccinia virus ankara (MVA), an important strain for vectorial vaccine applications. The N-glycosylation profile of MVA produced in avian cells reflected host properties. However, MVA-particles exhibited an increased sialylation state as compared with the cell membrane glycoproteins. We speculate that the virus promotes this state as MVA-particles with higher sialylation are protected against early clearing out of serum by asialoglycoprotein receptors. With the help of analysed cell membrane glycoproteins and rec.IgGs, elementary characteristics of the avian N-glycosylation profile could be determined. Thus the AGE1.CR and AGE1.CR.pIX cell lines showed an a2-3- and a2-6-linked Neu5Ac, bisecting-GlcNAc and core-fucosylation. Finally, in the avian N-glycosylation pro le no for human potent immunogenic monosaccharides, such as Xylose or Neu5Gc, could be found. Recombinant human IgG from AGE1.CR resembled low amounts of mannose rich structures as detected with CHO cells. Thus the new avian cell lines - AGE1.CR and AGE1.CR.pIX - exhibit a human-like N-glycosylation profile and appear suitable not only for virus production but also for production of therapeutic proteins.