Dysregulation des PD-1-Signalling von Monozyten bei Patient:innen unter Immuncheckpoint-Blockade-Therapie mit immun-assoziierten Nebenwirkungen

Abstract

Einleitung: Immun-assoziierte Nebenwirkungen (irAE) sind eine wesentliche Limitation der Immun-Checkpoint-Inhibitor-Therapie (ICI), die in den vergangenen Jahren die Behandlung diverser Tumorentitäten revolutioniert hat. IrAE weisen große Ähnlichkeiten zu Autoimmunerkrankungen auf und betreffen die Hälfte der ICI- Patient:innen (IP), wobei die Inzidenz aufgrund neuer Indikationen und des Einsatzes von Kombinationstherapien, die ein erhöhtes Risiko für irAE aufweisen, vermutlich steigt. Die zugrunde liegende Pathophysiologie ist nach wie vor schlecht verstanden. Unsere Arbeitsgruppe hat bei der Untersuchung der Reaktivität peripherer Leukozytenpopulationen im Anschluss an zelltypspezifische Stimulationen bei IP eine erhöhte Toll-Like-Rezeptor-2-Reaktivität (TLR2) von Monozyten festgestellt. Diese blieb bei IP mit irAE (AE-IP) aus, was zu der Hypothese führte, dass schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs), welche zum Teil TLR2-Liganden sind, in Kontext von irAE relevant sein könnten, zumal ihnen bei Autoimmunerkrankungen eine Schlüsselrolle zugeschrieben werden. Methoden: Mithilfe FACS-basierter in vitro-Assays wurde erstens untersucht, welche Prozesse die PD-1-Expression auf Monozyten modulieren, zweitens wie eine PD-1- Blockade die Reaktivität von Monozyten beeinflusst und drittens die Monozyten- Reaktivität im Anschluss an verschiedene Ko-Kulturen mit DAMPs analysiert. Mittels ELISA- und Immunoplex-Assays sowie cfDNA-Isolierung wurden verschiedene TLR2- Liganden und Zytokine bei den IP quantifiziert, um mögliche Faktoren zu identifizieren, die die Monozytenreaktivität modulieren. Ergebnisse: Durch Inkubation von PBMC konnte PD-1 auf Monozyten von gesunden Spender:innen (HC) induziert werden. Der bei IP beobachtete Anstieg der monozytären Reaktivität konnte in vitro bestätigt werden. Darüber hinaus wiesen HC- Monozyten durch die Anwesenheit von AE-IP-Sera eine abgeschwächte Zytokinproduktion nach TLR2-Stimulation auf, was auf einen löslichen Faktor im Serum der AE-IP hinweist, der für diesen Mechanismus verantwortlich sein könnte. Bei den AE-IP wurden erhöhte Level zellfreier DNA (cfDNA) beobachtet, welche mit dem Grad der Desensibilisierung von HC-Monozyten durch die IP-Sera korrelierte. Auch führte isolierte cfDNA von IP zu einer reduzierten Zytokin-Produktion sowie zu einer Herunterregulierung von PD-1 auf HC-Monozyten. Die Quantifizierung von DAMPs und Zytokinen bei den IP ergab zudem einen Anstieg des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 und des TLR2-Agonisten HMGB-1 bei jenen IP, die keine irAE entwickelten. Diskussion: Zusammenfassend wurden funktionelle Auswirkungen der PD-1-Blockade auf Monozyten charakterisiert und cfDNA als DAMP identifiziert, welches potenziell die TLR2-Reaktivität bei AE-IP beeinträchtigt. Perspektivisch könnte cfDNA eine Rolle als prädiktiver Biomarker für irAE sowie als therapeutisches Ziel spielen.

Introduction: Immune related adverse events (irAE) play a key role in immune checkpoint therapy (ICI), being one of the main limitations of this promising tool against cancer. Summarizing a variety of autoimmune disease-like side effects, mainly affecting skin, gastrointestinal tract and lung, but potentially any organ system, irAE occur in over half of patients receiving checkpoint therapy (IP) against PD-1, PD-L1 and CTLA-4 with numbers assumably rising due to a growing field of indications and the use of combination therapies which have an increased risk of causing irAE. The underlying mechanism remains unclear with some hypotheses being discussed, mainly referring to T cells as major disease drivers. Analyzing the reactivity of peripheral leukocyte populations upon cell-type-specific stimulation, our group found an increase of the Toll Like-Receptor 2-reactivity (TLR2) of monocytes in IP which was absent in patients with irAE (AE-IP). Therefore, we assumed a potential role of damage- associated molecular patterns (DAMPs), some of which are TLR2-Ligands, as they are being attributed a key role in autoimmune disease, which resemble irAE in its clinical characteristics. Methods: FACS based in vitro assays were established in order to first, examine mechanisms modulating the PD-1- expression, second, to characterize the effect of PD- 1-blockade on monocytes reactivity and third, to identify potential factors that could account for the altered TLR signaling patterns of AE-IP. By using ELISA- and Immunoplex-based assays as well as cfDNA isolation technique a variety of TLR2- Ligands were quantified in the IP aiming to identify possible factors dampening the monocyte reactivity. Results: PD-1-expression could be induced by incubating PBMC overnight. Also, the increase of monocytes reactivity following anti-PD-1-treatment observed in patients was validated in vitro. Furthermore AE-IP-sera led to a desensitization of TLR2-reactivity of healthy control (HC) monocytes, indicating a soluble factor that indeed accounts for this mechanism. Levels of cell free DNA (cfDNA) levels were found to be elevated in AE-IP and correlated with the degree in which the patients’ sera desensitized HC monocytes. Also, isolated cfDNA from IP led to a reduced production of cytokines and a downregulation of PD-1 in HC monocytes. In addition, quantification of cytokines and DAMPs in the IP revealed increasing levels of the anti-inflammatory cytokine IL-10 and the TLR2 agonist HMGB-1 in IP who didn’t develop irAE. Discussion: In conclusion, functional effects of blocking PD-1 on monocytes were characterized and cfDNA was identified as potential DAMP to hamper the TLR2 reactivity in AE-IP. Perspectively cfDNA could play a role as predictive biomarker for irAE as well as a therapeutic target to lower the negative effects of irAE without interfering with the effectiveness of ICI.