Analyse des Methylierungsstatus des menschlichen Typ I-5´-Deiodase Promotors in Schilddrüsenkarzinomen

Abstract

Als Schlüsselenzym im Schilddrüsenhormonmetabolismus vermittelt die Typ I-5´-Deiodase (5´D1) die Aktivierung des Prohormons T4 in das biologisch aktive T3. Etwa 70% des im Blut zirkulierenden systemischen T3 wird durch die 5´D1 bereitgestellt, die überwiegend in der Leber, der Niere, der Schilddrüse und der euthyreoten Hypophyse exprimiert wird. Dieses Enzym wird sowohl durch sein Produkt T3 als auch durch Retinsäure positiv reguliert, jedoch ist nur wenig darüber bekannt, welche Faktoren für eine negative Regulation verantwortlich sind. Die 5´D1 ist in Schilddrüsenkarzinomgewebe und Schilddrüsenkarzinomzelllinien signifikant herunterreguliert. Während 5´D1 eine hohe Aktivität in gesunden Schilddrüsen zeigt, ist ihre Aktivität hingegen in differenzierten Schilddrüsenkarzinomen reduziert und bei undifferenzierten Karzinomen sogar nicht mehr nachweisbar. Epigenetische Effekte wie Promotormethylierung führen zum Stilllegen von Genen, dem so genannten „Gene silencing“. In dieser Dissertationsarbeit wurde der Methylierungsstatus der humanen 5´D1 an wichtigen regulatorischen Bereichen des Promotors in Zusammenhang mit der Genexpression und Enzymaktivität in Schilddrüsenkarzinomgeweben und –zelllinien untersucht. Mit verschiedenen Methoden (direkte Sequenzierung Bisulfit modifizierter PCR-Produkte, Sequenzanalyse subklonierter PCR-Produkte und COBRA) konnte gezeigt werden, dass die in dieser Arbeit untersuchten regulatorischen Bereiche des 5´D1 Promotors, ein T3- und Retinsäure-responsives Element (DR+12) und eine Bindungsstelle für den Transkriptionsfaktor Sp1, zu unterschiedlichen Graden Methylierung in Schilddrüsenkarzinomgeweben und –zelllinien aufwiesen. Eine Methylierung des DR+12 Motivs war immer mit einer Methylierung der Sp1 Sequenz kombiniert. Der höchste Grad der Methylierung wurde bei den undifferenzierten Schilddrüsenkarzinomen, den aggressivsten Tumoren, bei denen keine 5´D1 Aktivität mehr nachgewiesen werden kann, detektiert. Bei Vorversuchen mit dem DNA-Methylierungsinhibitor 5-aza-2´-Deoxycytidine konnte die reduzierte 5´D1 Expression und Aktivität in Schilddrüsenkarzinomzelllinien restimuliert werden. Zum einen zeigt dies den Einfluss epigenetischer Effekte auf die Regulation der 5´D1, zum anderen eine mögliche therapeutische Option, die bei fortgeschrittenen Tumoren in Zukunft Anwendung finden könnte. Durch die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse kann die Liste der in Schilddrüsenkarzinomen durch Methylierung inaktivierten schilddrüsenspezifischen Gene somit um das Gen der humanen Typ I 5´-Deiodase erweitert werden.

As a key enzyme in thyoid hormone metabolism the human type I iodothyronine deiodinase (5´D1) catalyzes the activation of the prohormone T4 to the biologically active T3 and contributes mainly to circulating T3. Expression of 5´D1 is found in the thyroid gland, liver, kidney and pituitary gland. T3 and retinoic acid lead to enzyme induction, but little is known about factors for negative regulation. 5´D1 is significantly down-regulated in thyroid carcinoma tissue and thyroid carcinoma cell lines. The enyzme shows high activity in healthy thyroid glands, but its activity is reduced in differentiated thyroid carcinomas and even undetectable in undifferentiated carcinomas. Epigenetic effects such as promotor methylation lead to gene silencing. In this doctoral thesis the methylation status of the human 5´D1 was analyzed at important regulatory regions of the gene promotor in context with gene expression and enzyme activity in thyroid carcinoma tissues and cell lines. By using different methods (direct sequencing of bisulfite modified PCR products, sequence analysis of subcloned PCR products and COBRA) it was demonstrated that the analyzed regulatory regions of the 5´D1 promotor showed different degrees of methylation in thyroid carcinoma tissues and cell lines. These regulatory regions contained a thyroid hormone responsive element (DR+12) and a binding site for the transription factor Sp1. Meythlation of the DR+12 element was always combined with methylation of the Sp1 site. The highest degree of methylation was found in undifferentiated thyroid carcinomas, the most aggressive tumors, which exhibit no 5´D1 activity. Previous experiments with the DNA methylation inhibitor 5-aza-2´deoxycytidine showed that reduced 5´D1 expression and activity could be re-stimulated in thyroid carcinoma cell lines. This shows on the one hand the impact of epigenetic effects on 5´D1 regulation, on the other hand a potential therapeutical option in the future for advanced tumors. With the findings of this work the list of inactivated thyroid specific genes in thyroid carcinomas via methylation can be expanded by the human type 1 iodothyronine deiodinase gene.