Funktionelle Charakterisierung von Orexinrezeptoren in 3T3-L1 Adipozyten

Abstract

Einleitung: Orexin ist ein Neuropeptid, das in 2 Isoformen, Orexin A und B, vorkommt und über 2 Rezeptortypen, Orexinrezeptor-1 und Orexinrezeptor-2, interagiert. Patienten mit Narkolepsie haben einen niedrigeren Orexin A Spiegel im Liquor, häufiger einen Diabetes mellitus Typ 2 und Übergewicht. Auch bei übergewichtigen Individuen ohne Diabetes mellitus wurden niedrigere Orexin A Plasmaspiegel als bei Normalgewichtigen gemessen. Fettgewebe exprimiert Orexinrezeptoren. In vitro wurde gezeigt, dass Orexin A die PPARy Expression im Fettgewebe erhöht. Da PPARy eine Rolle im Lipidstoffwechsel spielt und die Insulinempfindlichkeit steigert, stellte sich die Frage, welchen Einfluss Orexin A auf den Lipidstoffwechsel und Glukosemetabolismus in Adipozyten hat. Methoden: 3T3-L1 Fibroblasten wurden zunächst zu reifen Adipozyten differenziert. Diese wurden anschließend mit Orexin A und in An- bzw. Abwesenheit von Insulin inkubiert. Um die Expression der Orexinrezeptoren-1 und -2, sowie von Adiponectin, PPARy und den Glukosetransporter 4 (GLUT4) zu quantifizieren, wurde aus den reifen Adipozyten RNS isoliert und deren Konzentration mithilfe der quantitativen PCR bestimmt. Eine qualitative Bestimmung der Proteine erfolgte mit dem Western Blot. Die Glycerolkonzentration wurde im Inkubationsmedium bestimmt. Der Triglyceridgehalt und die Glukoseaufnahme wurden in den Adipozyten gemessen und die intrazelluläre Fettakkumulation mithilfe des Oil Red O dargestellt. Die indirekte Immunfluoreszenz diente zur Visualisierung der GLUT4 Rezeptoren. Die quantitative Bestimmung der Adiponectinsekretion erfolgte mit dem Radioimmunoassay. Die Hemmung der PPARy Expression wurde mithilfe der siRNS durchgeführt. Validierung des Versuches erfolgte mittels real-time PCR und Western Blot. Ergebnisse: Die Orexinreptoren-1 und -2 werden sowohl in unreifen als auch in reifen Adipozyten exprimiert. In reifen Adipozyten ließ sich eine stärkere Expression von Orexinrezptoren-1 im Vergleich zu Orexinrezeptoren-2 nachweisen. Orexin A erhöht die Glukoseaufnahme in reifen 3T3-L1 Adipozyten. Dieser Vorgang ist von einer Zunahme der GLUT4 Translokation aus dem Zytoplasma in die Plasmamembran begleitet. Pharmakologische Blockade der PI3K abhängigen Signaltransduktionskaskade führt zu einer Inhibition der Glukoseaufnahme und Blockade der GLUT4 Translokation. Die Lipolyse in den 3T3-L1 Adipozyten wurde durch Orexin A gehemmt, die Lipidakkumulation über einen PI3K- und PPARy abhängigen Mechanismus stimuliert. Die PPARy mRNS Expression nahm nach Inkubation mit Orexin A signifikant zu. Orexin A verstärkte zusätzlich die Insulin stimulierende PPARy mRNS Expression. Die Adiponectinsekretion und -expression wurden ebenfalls durch Orexin A stimuliert. Die Inkubation mit einem PPARy Antagonisten bzw. die experimentelle Suppression der PPARy Expression führte zu einer signifikanten Hemmung der Lipidakkumulation und Adiponectinexpression. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse der Arbeit zeigen, dass Orexin A Ähnlichkeit mit den in der Klinik bereits bekannten Insulinsensitizern (PPARy Rezeptor- Aktivatoren) im Hinblick auf die Regulation der Glukoseutilization und Lipidakkumulation hat. Daher könnte Orexin A eine mögliche Therapieoption beim Diabetes mellitus Typ 2 werden.

Introduction: Orexin is a neuropeptide which exists in two isoforms: orexin A and B. Both orexins interact with 2 receptor subtypes, orexin receptor-1 and orexin receptor-2. Patients with narcolepsy show lower levels of orexin A in the cerebro spinal fluid. Higher incidences of type 2 diabetes and obesity are reported in narcoleptic patients. According to this, obese non-diabetic patients show lower plasma orexin A levels than individuals of normal body weight. Adipocytes express orexin receptors. Orexin A increases the PPARy expression in adipocytes. Because the PPARy plays a role in lipid metabolism and improves insulin sensitivity, I investigated if orexin A influences lipid and glucose metabolism in adipocytes. Materials and Methods: 3T3-L1 fibroblasts were differentiated to mature adipocytes. Mature adipocytes were incubated with orexin A in the presence or absence of insulin. To determine the expression of orexin receptor-1 and -2, adiponectin, PPARy and glucose transporter 4 (GLUT4) proteins and RNA were isolated and the concentration was measured. Proteins were detected using Western blot; RNA was measured by real- time PCR. The glycerol concentration was quantified in the incubation medium. The triglyceride concentration and glucose uptake were measured in adipocytes. The intracellular lipid accumulation was determined by Oil Red O assay. Visualization of GLUT4 receptors were performed by immunofluorescence. Adiponectin secretion was measured by using a radioimmunoassay. PPARy expression was reduced using small interfering RNA. Validation was performed using real-time PCR and Western blot. Results: Orexin receptor-1 and -2 are expressed in 3T3-L1 fibroblasts (preadipocytes) and in mature adipocytes. In mature adipocytes the expression of orexin receptor-1 is higher than the expression of orexin receptor-2. Orexin A stimulates glucose uptake in mature 3T3-L1 adipocytes, which is accompanied by a GLUT4 translocation from cytoplasm into the plasma membrane. Pharmacological blockade of the PI3K dependent signal transduction cascade results in inhibition of glucose uptake and attenuation of GLUT4 translocation. Orexin A inhibits lipolysis and stimulates lipid accumulation via a PI3K- and PPARy-dependent pathway. Orexin A stimulates PPARy mRNA expression and potentiates insulin-stimulated PPARy mRNA expression. Orexin A stimulates adiponectin secretion and expression. Incubation of adipocytes with a PPARy antagonist or experimental suppression of the PPARy expression led to an inhibition of lipid accumulation and adiponectin expression. Conclusion: The results of the study show that orexin A resembles functionally the clinically well-known insulin sensitizers (PPARy receptor activators) in view of the regulation of glucose utilization and lipid accumulation. Due to these activities orexin A could offer a new therapeutic option for type 2 diabetes mellitus.