Der Einfluss der circadianen Uhr auf die Frakturheilung im murinen Bmal1-Knockout-Modell

Abstract

Hintergrund: Circadiane Rhythmen beeinflussen grundlegende physiologische Mechanismen aller Säugetiere: U. a. den Hormonhaushalt, die Stoffwechselaktivität und Heilungsprozesse. Bekannt ist außerdem ein Einfluss auf die Knochenhomöostase beispielsweise bei Schichtarbeitern, die von einem erhöhten Osteoporose- und Frakturrisiko betroffen sind. Die Rolle der circadianen Uhr in der Frakturheilung ist hingegen noch unbekannt. Methoden: Der Einfluss der circadianen Uhr auf die Frakturheilung wurde in 10 Wochen alten weiblichen, Bmal1-defizienten Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Geschwistern (WT) untersucht. Durch einen genetischen Knockout (KO) von Bmal1, einem zentralen Schrittmacherprotein der circadianen Uhr, kommt es zu einem gestörten Tag-Nacht-Rhythmus. Zur Sicherstellung einer circadianen Desynchronisation wurden die Tiere ab der zweiten Versuchswoche in dauerhafter Dunkelheit gehalten. Zunächst erhielt jedes Tier ein subkutanes Chip-Implantat, um das Bewegungsprofil mithilfe elektromagnetischer Wellen aufzuzeichnen. Zwei Wochen später erfolgte eine Femurosteotomie mit einem Fixateur externe. Die Probengewinnung (n = 8 pro Genotyp und Zeitpunkt) erfolgte 7, 14 und 21 Tage postoperativ. Anschließend wurde der Knochen in der Mikro-Computertomographie (μCT) morphologisch und danach histologisch mit der Movat-Pentachrom- und TRAP-Färbung untersucht. Um die Zusammenhänge zwischen KO, Fraktur, Dunkelhaltung und Stressreaktion zu beurteilen, erfolgte außerdem eine Corticosteron-Messung im Haar. Ergebnisse: Die Bewegungsanalyse zeigte ein arrhythmisches Bewegungsprofil der KO-Mäuse sowohl unter 12-Stunden Hell-Dunkel-Bedingungen als auch in dauerhafter Dunkelheit, während die WT in 24-stündiger Dunkelheit ihr rhythmisches Bewegungsmuster behielten. Die Stresshormonmessung zeigte, dass Dunkelhaltung und Fraktur weder im WT noch im KO einen signifikanten Einfluss auf den Corticosteron-Spiegel im Haar hatten. Der intakte Knochen wies im KO eine signifikant schlechtere Qualität auf. Im μCT zeigte sich im KO eine signifikant verschlechterte Frakturheilung an d 7, d 14 und d 21 im Vergleich zum WT. Histologisch ließen sich im KO eine geringere Überbrückung des Frakturspalts und signifikant weniger Osteoblasten und Osteoklasten feststellen. Schlussfolgerung: In dieser Studie konnte erstmals gezeigt werden, dass eine globale Störung der circadianen Uhr durch einen Bmal1-Knockout die Frakturheilung im Mausmodell verschlechtert. Daraus ergeben sich wichtige translationale Anknüpfungspunkte, die beispielsweise in Form einer Chronotherapie dazu beitragen können, die Frakturversorgung zu verbessern.

Background: Circadian rhythms influence fundamental physiological mechanisms in all mammals: These include hormone balance, metabolic activity and healing processes. It is also known, that circadian rhythms have an impact on bone homeostasis – for example in shift workers, who suffer from an increased osteoporosis and fracture risk. However, in fracture healing the role of the circadian clock is still unknown. Methods: The influence of the circadian clock on fracture healing was investigated in 10-week-old female Bmal1-deficient mice compared to wild-type (WT) littermates. A genetic knockout (KO) of Bmal1, a central pacemaker protein of the circadian clock, results in a disturbed day-night rhythm. To ensure circadian desynchronization, the animals were kept in permanent darkness from the second week of the experiment. First, each animal received a subcutaneous chip implant to record the movement profile using electromagnetic waves. Two weeks later, a femoral osteotomy with external fixation was performed. Samples were collected 7, 14 and 21 days after the femoral osteotomy (n = 8 per genotype and time point). Subsequently, the bone was examined morphologically using micro-computed tomography (μCT) and then histologically using Movat-Pentachrome and TRAP staining. To assess the relationship between KO, fracture, darkness and stress response, a corticosterone measurement was also performed in the hair. Results: The movement analysis showed an arrhythmic movement profile of the Bmal1-deficient mice both under 12-hour light-dark conditions and in constant darkness, while the WT retained their rhythmic movement pattern in constant darkness. The stress hormone measurement showed, that neither constant darkness nor the fracture had a significant influence on corticosterone levels in hair of WT or KO. The intact bone showed a significantly compromised quality in the KO. The μCT showed significantly impaired fracture healing at d 7, d 14 and d 21 in KO compared to WT. Histologically, there was less bridging of the fracture gap and significantly fewer osteoblasts and osteoclasts in the KO-group. Conclusion: This study was the first to show, that a disruption of the circadian clock by a global Bmal1-knockout impairs fracture healing in a mouse model. These results provide important translational findings, that could contribute to improve fracture care, for example in the form of a chronotherapy.