Mitochondria, as membrane-bound, dynamic organelles, are integral for normal cellular functions in eukaryotic cells. Its intricate organization into multiple compartments, each serving distinct functions and hosting diverse protein complexes, emphasizes the complexity of its role in cellular processes. Comprehensive inventories of the mitochondrial proteome have been provided by mass spectrometry-based proteomics. However, our understanding of the spatial arrangement, interactome and assembly of macromolecular complexes in each mitochondrial sub-compartment is still incomplete. Here, I introduce MitoMap, a coarse-grained model of the mitochondrial proteomic landscape, integrating crosslinking mass spectrometry, quantitative proteomics and advanced microscopy techniques. MitoMap aims to provide a comprehensive spatial three-dimensional model of the mitochondrial interactome, offering insights into protein distributions, interactions, and higher-order organization of complexes. I utilized crosslinking mass spectrometry on purified mitochondria, resulting in an extensive mitochondrial protein-protein interaction (PPI) network, encompassing over 1200 mitochondrial and associated proteins, with over 6,000 PPIs and over 26,000 unique crosslinks. Subsequent validation of crosslinking-based predictions of protein localizations and topologies, along with the measurement of sub-compartmental volumetric sizes using super-resolution and electron microscopy, further refined the MitoMap model. In combination with mathematical modeling based on normalized protein copy numbers and protein sizes derived from experimental data, MitoMap enhances the understanding of protein distributions within mitochondrial compartments such as the matrix, intermembrane space (IMS) and inner mitochondrial membrane (IMM). Utilizing MitoMap, I uncovered and investigated novel mitochondrial proteins. Notably, FAS-associated factor 2 (FAF2) was explored for its potential role as a tether at mitochondria-ER contact sites (MERCS) using proximity-based fluorescent assays. Similarly, coiled-coil domain-containing protein 127 (CCDC127), as an interaction partner of the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, was investigated for its contribution to maintaining mitochondrial cristae structure. Anticipating that the comprehensive MitoMap dataset will inspire further functional studies and facilitate deeper exploration into mitochondrial biology, this research highlights the potential of crosslinking-assisted modeling in unraveling the complexities of mitochondrial architecture and protein organization.
Mitochondrien sind als membrangebundene, dynamische Organellen für die normalen zellulären Funktionen in eukaryontischen Zellen von zentraler Bedeutung. Ihre komplizierte Organisation in mehrere Kompartimente, die jeweils unterschiedliche Funktionen erfüllen und verschiedene Proteinkomplexe beherbergen, unterstreicht die Komplexität ihrer Rolle in den zellulären Prozessen. Umfassende Inventuren des mitochondrialen Proteoms wurden durch Massenspektrometrie basierende Proteomik erstellt. Unser Verständnis der räumlichen Anordnung, des Interaktoms und des Aufbaus makromolekularer Komplexe in jedem mitochondrialen Kompartiment ist jedoch noch unvollständig. Hier stelle ich MitoMap vor, ein grobkörniges Modell des mitochondrialen Proteoms, welches vernetzende Massenspektrometrie, quantitative Proteomik und fortgeschrittene Mikroskopie Methoden integriert. MitoMap zielt darauf ab, ein umfassendes, räumliches, dreidimensionales Modell des mitochondrialen Interaktoms zu erstellen, dass Einblicke in Proteinverteilungen, Interaktionen und die übergeordnete Organisation von Komplexen bietet. Ich habe die Crosslinking-Massenspektrometrie an aufgereinigten Mitochondrien angewendet, was zu einem umfangreichen mitochondrialen Protein-Protein-Interaktions-Netzwerk (PPI) führte, das über 1200 mitochondriale und assoziierte Proteine mit über 6.000 PPIs beinhaltet und über 26.000 einzigartige Crosslinks umfasst. Die anschließende Validierung von Vorhersagen zu Proteinlokalisationen und -topologien auf der Grundlage von Crosslinks sowie die Messung von Volumengrößen von mitochondrialen Kompartimenten, mithilfe von hochauflösender Mikroskopie und Elektronenmikroskopie, haben das MitoMap-Modell weiter verfeinert. In Kombination mit einer mathematischen Modellierung, die auf normalisierten Protein-Kopienzahlen und aus experimentell abgeleiteten Proteingrößen basiert, verbessert MitoMap das Verständnis der Proteinverteilungen innerhalb mitochondrialer Kompartimente wie der Matrix, dem Intermembranraum (IMS) und der inneren mitochondrialen Membran (IMM). Mithilfe des MitoMap-Modells habe ich neue mitochondriale Proteine entdeckt und untersucht. Insbesondere wurde der FAS-assoziierte Faktor 2 (FAF2) auf seine potenzielle Rolle als Tether an Mitochondrien-ER-Kontaktstellen (MERCS) mit Hilfe eines näherungsbasierten Fluoreszenz-Assay untersucht. In ähnlicher Weise wurde das Coiled-Coil-Domain-enthaltende Protein 127 (CCDC127) als Interaktionspartner des mitochondrialen Kontaktstellen und Cristae-Organisationssystem (MICOS)-Komplexes auf seinen Beitrag zur Erhaltung der mitochondrialen Cristae Struktur untersucht. In der Erwartung, dass der umfassende MitoMap-Datensatz weitere funktionelle Studien anregen und eine tiefere Erforschung der mitochondrialen Biologie ermöglichen wird, unterstreicht diese Forschungsarbeit das Potenzial der vernetzungsgestützten Modellierung, um die Komplexität der mitochondrialen Architektur und Proteinorganisation zu entschlüsseln.
