Die Aktivierung von Mikrogliazellen nach experimentell induzierter Subarachnoidalblutung: eine intraparenchymatöse Reaktion auf eine extraparenchymatöse Erkrankung

Abstract

Ist eine Person von einer aneurysmatischen Subarachnoidalblutung (aSAB) betroffen, so kann es auf bisher zum Teil ungeklärte Weise im Rahmen der sich anschließenden pathophysiologischen Veränderungen zu einer Entstehung neuronaler Schädigung kommen. Die Hypothese der vorliegenden Promotion ist, dass es zu einer zellulären Reaktion kommt, die in Zusammenhang mit der neuronalen Schädigung nach aSAB steht. Hierbei stand im Zentrum die Rolle der Mikrogliazellen zu charakterisieren. Methoden Es erfolgte die Induktion einer aSAB bei C57Bl/6 Mäusen mittels des endovaskulären Fadenperforationsmodells. Zunächst wurden die Gehirne an den Tagen 2, 4, 7, 14 und 28 gewonnen und eine immunhistochemische Färbung von Iba-1, GFAP sowie APP durchgeführt. Im nachfolgenden Schritt wurden die Gehirne an Tag 4, 14 und 28 und eine entsprechende Zellsuspension gewonnen. Anschließend erfolgte die Isolierung einer CD11b-positiven Zellfraktion mittels eines Magnetfelds und die Extraktion von RNA aus dieser. Nach dem Umschreiben in cDNA, erfolgte die Echtzeit-PCR zur relativen Quantifizierung der Zytokine IL1a, IL1b, IL6, TNF sowie der entsprechenden Rezeptoren. Die Produktion von TNF und IL6 auf Proteinebene wurde mittels FACS-Analyse untersucht. Ergebnisse Im Rahmen der immunhistochemischen Färbungen zeigt sich eine Zunahme des Nachweises von GFAP, APP und Iba-1 im Zeitraum von Tag 2 bis 14. Bezüglich der Zytokine IL1a und IL6 zeigt sich eine Zunahme der Expression im Zeitraum von Tag 5 bis 28, während die von IL1b konstant erhöht ist. Im Gegensatz dazu findet sich für TNF an Tag 5 und 14 eine Zunahme, an Tag 14 jedoch eine deutliche Abnahme der Expression. Für IL6 können wir das Ergebnis auf Proteinebene bestätigen. Hinsichtlich der Zytokinrezeptoren, zeigt sich für IL1R1 keine Änderung der Expression. Die Expression von IL1R2 ist an Tag 5 maximal erhöht und fällt an Tag 14 auf ein niedrigeres Niveau, welches mit Tag 28 vergleichbar ist. Der IL6R sowie TNFR2 werden im Zeitverlauf von Tag 5 bis 28 zunehmend exprimiert. Die Expression von TNFR2 nimmt ebenfalls bis Tag 14 zu und fällt an Tag 28 wieder ab. Schlussfolgerung Es zeigte sich eine signifikanten Aktivierung und Akkumulation von Mikrogliazellen im Anschluss an eine aSAB. Zudem fand sich ein Hinweis auf einen Zusammenhang mit der neuronalen Schädigung. Des Weiteren erfolgte die Charakterisierung der Mikrogliazellaktivierung anhand der Erstellung eines mikroglialen Expressionsprofils inflammatorischer Zytokine. Dabei ließ sich eine veränderte Expression feststellen. Diese Promotion liefert damit weitere Hinweise für die einer frühen Hirnschädigung zugrunde liegenden Mechanismen im Anschluss an eine aSAB und bildet die Grundlage für weitere Experimente bzw. therapeutische Ansätze.

Within the last years different theories about early brain injury (EBI) following aneurysmatic subarachnoid hemorrhage (aSAH) were discussed. We focus on the theory considering inflammatory processes as cause respectively consequence of EBI. Therefore we first evaluated the activation of Microglia in murine brain slices following aSAH and subsequently characterized the activation by evaluating the production of inflammatory cytokines known to play an important role in the pathomechanism of a variety of CNS diseases. Methods C57Bl/6 mice underwent a filament perforation procedure to induce SAH. First, the brains were harvested after day 2, 4, 7, 14 and 28 respectively and immunohistochemical staining was performed for Iba-1, GFAP as well as APP. Secondly, the brains were harvested after day 5, 14 and 28 respectively and after having got a cell suspension, a CD11b positive cell fraction was isolated by magnetically activated cell sort (MACS). Subsequently the RNA was extracted. This RNA was transcribed into cDNA and realtime-PCR was performed to quantify the expression of the cytokines IL1a, IL1b, IL6, TNF as well as their receptors in a relative way. The production of TNF and IL6 on protein level was quantified by a FACS analysis. Results Concerning murine brain slices there is an increase of GFAP, APP and IBA1 over a period of day 2 till 14. Concerning IL1a and IL6, there is an increase in expression up regulation from day 5 till day 28 after aSAH whereas the expression of IL1b is constantly up regulated. The RNA production of TNF is down regulated on day 5 and 28, but up regulated on day 14. A significant change in the expression couldn’t be detected for the IL1R1 whereas the expression of the IL1R2 has its maximum on day 5 and rests on almost the same level concerning day 14 and 28. In case of the IL6R and TNFR1 an increase can be observed from day 5 till day 28. As to the TNFR2, its RNA production increases from day 5 to day 14 and is decreased again on day 28. Conclusion The time elapsed of an intraparenchymal inflammatory reaction following an extraparenchymal aSAH can be observed. There is an augmentation in activation of Microglia and APP being a marker for axonal injury a potential proof for a correlation between inflammation and brain damage after aSAH. Furthermore a significant change in the cytokine expression profile of Microglia can be observed. The results provide an indication of the underlying molecular mechanisms of brain damage genesis after aSAH respectively an approach for scientific as well as therapeutic aims.