Protein Phosphatase Inhibition and Cellular Uptake of Semi-Synthetic Microcystin Derivatives - Investigation of Microcystins as Leads for Drug Development

Abstract

Cancer is among the leading diseases and causes for deaths worldwide. Even with a rise of treatment options in the last century, cancer therapy can still be limited and insufficient due to side-effects and drug resistances. Therefore, novel approaches have to be explored to overcome these limitations. In recent years, the development and application of antibody-drug conjugates, a combination of a highly cytotoxic payload with a target specific monoclonal antibody, have been receiving increasing attention. The majority of employed payloads in these antibody-drug conjugates can be considered as natural products or derivatives of these. Natural products make an important source for the development of novel anti-cancer drugs. Recently, microcystins, cyanobacterial cyclic heptapeptides, have been discussed as leads for the development of anti-cancer drug substances. Microcystins exhibit a high target toxicity by inhibiting eukaryotic serine/threonine protein phosphatases 1 and 2A. Unlike many cytotoxins that can cross cell membranes by passive diffusion, they depend on active uptake via organic anion transporting polypeptides 1B1 or 1B3, which are especially expressed by liver cells. This leads to a hepatotoxicity of microcystins and might limit the direct use of natural occuring microcystins as payloads. The aim of this thesis was to find optimized microcystins for use as payloads in antibodydrug conjugates. To maximize effectivity in targeted cells while reducing side-effects through uncontrolled uptake, these derivatives should display a high protein phosphatase inhibition potential but an overall low uptake by their transporters. As both phosphatase inhibition and transportability strongly depend on the structure of the individual microcystin, so-called clickable microcystins were modified with chemically diverse small molecules using click chemistry and tested for their bioactivity. A workflow for synthesis of new microcystins derivatives, structural confirmation, isolation, and quantification was developed. Two different kinds of click reactions, coppercatalyzed and strain-promoted, were used for synthesis. Different chromatographic approaches were chosen depending on the chromatographic issue, including solid-phase extraction, preparative, semi preparative, and analytical HPLC. Also, different detection methods depending on the analytical problem were used, e.g., mass spectrometry and tandem mass spectrometry for structural confirmation and an evaporative light-scattering detector for structure-independent quantification. 46 new microcystin derivatives were obtained and characterized through this workflow. In a second step, the influence of the small molecules on the bioactivity profile of microcystins was evaluated: an already established cytotoxicity assay was used to test for transportability, and a protein phosphatase 1 inhibition assay was established to test for target toxicity. The inhibition assay was complemented by a pharmacophore modeling approach. The results revealed that target inhibition and transportability of microcystins can independently be influenced by the physicochemical properties especially of the residue located in position 2 of the microcystin. The selectivity of the two transporters was evaluated to understand similarities and differences in substrates. Moreover, a ratio of transportability over inhibition potential was calculated to find optimized microcystins with high target toxicity but overall low transportability. It was shown that derivatization with small carboxylic acids or amino acids resulted in microcystins with a favorable ratio of inhibition to transportability, making these derivatives potentially suitable for application as payloads in antibody-drug conjugates.

Krebs gehört weltweit zu den häufigsten Erkrankungen und Todesursachen. Obwohl sich die Behandlungsmöglichkeiten im letzten Jahrhundert verbessert haben, ist Krebstherapie trotzdem oft durch Nebenwirkungen und Tumor-assoziierte Arzneimittelresistenzen eingeschränkt und unzureichend. Um diese Einschränkungen zu überwinden, werden neue Ansätze verfolgt. In den letzten Jahren hat die Entwicklung und Anwendung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten, einer Kombination aus einem hochgradig zytotoxischen Wirkstoff und einem zielspezifischen monoklonalen Antikörper, zunehmend an Bedeutung gewonnen. Die meisten der in diesen Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten verwendeten Wirkstoffe sind Derivate von Naturstoffen, welche im Allgemeinen eine wichtige Quelle für die Entwicklung neuer Krebsmedikamente sind. Microcystine, eine Klasse zyklischer Heptapeptide aus Cyanobakterien, werden seit einigen Jahren als Leitstrukturen für die Entwicklung von Krebsmedikamenten diskutiert. Microcystine wirken stark toxisch durch Hemmung der eukaryotischen Serin/Threonin-Proteinphosphatasen 1 und 2A. Im Gegensatz zu vielen anderen Toxinen können sie die Zellmembran nicht durch passive Diffusion überwinden und sind daher auf einen aktiven Transport durch die Organo-Anion-Transporter 1B1 oder 1B3 angewiesen. Diese Transportproteine werden insbesondere von Leberzellen exprimiert, weshalb Microcystine hepatotoxisch wirken können. Diese Hepatotoxizität schränkt die direkte Verwendung von natürlich vorkommenden Microcystinen als Wirkstoffe in Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten ein. Das Ziel dieser Arbeit war es, optimierte Microcystine für die Verwendung als Wirkstoffe in Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten zu finden. Um die Wirksamkeit in den Zielzellen zu maximieren und gleichzeitig die Nebenwirkungen durch unkontrollierte Aufnahme zu reduzieren, sollten solche Microcystine ein hohes Inhibitionspotenzial für Proteinphosphatasen, aber eine insgesamt geringe Aufnahme durch ihre Transporter aufweisen. Da sowohl die Phosphatasehemmung als auch die Transportierbarkeit stark von der Struktur des einzelnen Microcystins abhängen, wurden sogenannte clickbare Microcystine mit chemisch unterschiedlichen niedermolekularen Molekülen mittels Click- Chemie modifiziert und auf ihre Bioaktivität getestet. Es wurde ein Arbeitsablauf für die Synthese neuer Microcystin-Derivate, deren Strukturbestätigung, Isolierung und Quantifizierung entwickelt. Für die Synthese wurden zwei Arten von Clickreaktionen verwendet: kupferkatalysierte und spannungsunterstützte. Je nach chromatographischem Problem wurden verschiedene chromatographische Methoden verwendet, unter anderem Festphasenextraktion, präparative, semipräparative und analytische HPLC. Außerdem wurden abhängig von der analytischen Fragestellung unterschiedliche Nachweismethoden eingesetzt, z.B. Massenspektrometrie und Tandem-Massenspektrometrie zur Strukturbestätigung und ein Lichtstreudetektor zur strukturunabhängigen Quantifizierung. Auf diese Weise wurden 46 neue Microcystin-Derivate gewonnen und charakterisiert. Im zweiten Schritt wurde der Einfluss der eingebrachten niedermolekularen Moleküle auf das Bioaktivitätsprofil der Microcystine bewertet: Ein bereits etablierter Zytotoxizitätstest wurde zur Prüfung der Transportierbarkeit und ein Proteinphosphatase-1-Inhibitionstest zur Prüfung der Hemmung des Zielenzyms eingesetzt. Dies wurde durch ein Pharmakophor-Modell unterstützt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Hemmung des Zielenzyms und die Transportierbarkeit von Microcystinen unabhängig voneinander durch die physikochemischen Eigenschaften, insbesondere durch den Rest in Position 2 des Microcystins, beeinflusst werden können. Die Selektivität der beiden Transporter wurde bewertet, um Ähnlichkeiten und Unterschiede hinsichtlich ihrer Substratpräferenzen zu identifizieren. Außerdem wurde ein Verhältnis von Transportierbarkeit zu Hemmungspotenzial berechnet, um optimierte Microcystine mit hoher Toxizität gegenüber dem Zielenzym, aber insgesamt geringer Transportierbarkeit zu finden. Es konnte gezeigt werden, dass die Derivatisierung mit kleinen Carbonsäuren oder Aminosäuren zu Microcystinen mit einem günstigen Verhältnis von Hemmung zu Transportierbarkeit führt. Solche Derivate eignen sich potenziell für den Einsatz als Wirkstoffe in Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten.