Die zunehmende Alterung unserer Gesellschaft hat zur Folge, dass altersbedingte Erkrankungen, wie z. B. Typ-2 Diabetes, vermehrt auftreten. Dies bringt sowohl wirtschaftliche als auch große soziale Probleme mit sich. Ernährungsbezogene Präventionsansätze befassen sich daher u. a. mit dem Einfluss von Nahrungsbestandteilen auf die Expression krankheitsrelevanter Gene. Die Deacetylase SIRT1, die durch kleine Moleküle in ihrer Aktivität reguliert werden kann, steuert diverse Stoffwechselprozesse, die mit altersbedingten Erkrankungen in Verbindung stehen. In der Vergangenheit wurden verschiedene Screeningmethoden zur Detektion SIRT1-modulierender Substanzen entwickelt. Allerdings weisen viele der verfügbaren SIRT1-Screeningmethoden Nachteile auf, etwa die Generierung von Artefakten aufgrund von Fluoreszenzdetektion und/oder -markierung. Um dieses Problem zu lösen wurde in der vorliegenden Arbeit eine MALDI-TOF MS-basierte Screeningmethode entwickelt. Anhand dieser Methode kann die Deacetylierung eines Peptidsubstrates aufgrund seiner um 42 Da verringerten Masse detektiert werden, ohne dass eine Substratmarkierung erforderlich ist. Die Methode wurde so optimiert, um sie einerseits als Hochdurchsatz-Screeningmethode, und andererseits zur nachfolgenden Charakterisierung der ermittelten SIRT1-Modulatoren verwenden zu können. Die Methodenentwicklung sowie das Screening einer Naturstoffbibliothek wurden mit einem unmarkierten und mit einem fluoreszenzmarkierten Peptid durchgeführt. Das unmarkierte Peptid diente dabei der Erzielung artefaktfreier Ergebnisse. Das fluoreszenzmarkierte Peptid wurde hingegen zur Detektion artifizieller SIRT1-Aktivatoren eingesetzt, um strukturelle Ähnlichkeiten zu anderen SIRT1-Aktivatoren aufzeigen zu können. Aus dem Screening resultierten acht SIRT1-Inhibitoren und ein artifizieller SIRT1-Aktivator. Diese Substanzen wurden in vitro und in verschiedenen Zellsystemen überprüft. Dabei zeigte der stärkste SIRT1-Inhibitor NP1 im Zellsystem eine reduzierte p53-Deacetylierung. Der artifizielle SIRT1-Aktivator NP9, der mit einem IC50 -Wert von 1,7 µM zudem ein sehr starker p300-Inhibitor ist, wies eine stark antiinflammatorische Wirkung auf. Anhand der Histonacetyltransferase p300 wurde gezeigt, dass die MALDI-TOF MS Methode sich auch zur Detektion der Umkehrreaktion eignet. Zudem bietet die Methode die Möglichkeit, die Aktivität vieler weiterer posttranslationaler Enzyme zu messen.
The progressive increase in life expectancies of our society results in an increasing prevalence of age-related diseases like type-2 diabetes. This causes economic as well as vast social problems. Therefore, nutrition related preventive approaches include for example the influence of dietary components on the expression of disease related genes. The deacetylase SIRT1 can be regulated by small molecules and controls several metabolic processes that influence age-related diseases. Several methods to screen for SIRT1 modulating compounds have been developed in the past. However, many of the available SIRT1 screening methods bear disadvantages such as artifact generation because of fluorescence detection and/or labeling. Hence, in the present work a more advantageous MALDI-TOF MS based screening method was developed. Applying this method, deacetylation of a peptide substrate can be detected by a 42 Da mass shift without the need of any substrate labeling. The method was optimized to serve as a high-throughput screening system as well as for subsequent characterization of detected SIRT1 modulators. Method development as well as screening of a natural product library was conducted using an unlabeled and a fluorescently labeled peptide. The unlabeled peptide was used to generate artifact-free results. In contrast, the fluorescently labeled peptide was applied for the detection of artificial SIRT1 activators, in order to demonstrate structural similarities to other SIRT1 activating compounds. The screening resulted in eight SIRT1 inhibitors and one artificial SIRT1 activator. These compounds were further tested in vitro and in different cell lines. Cell treatment with the most potent SIRT1 inhibitor NP1 revealed reduced p53 deacetylation. The artificial SIRT1 activator compound NP9, which is also a very strong inhibitor of p300 with an IC50 value of 1.7 µM, showed a strong antiinflammatory effect. By employing the histone acetyltransferase p300, the applicability of the MALDI-TOF MS based method for the reverse reaction was demonstrated. Moreover, the presented method provides the opportunity to measure the activity of many other post-translationally active enzymes.
