Die kurzkettige Fettsäure Butyrat stabilisiert die epitheliale Barrierefunktion des Darmes durch HNF-4α-abhängige Herabregulierung der Claudin-2-Expression

Abstract

Es ist bekannt, dass die kurzkettige Fettsäure Butyrat protektive Effekte auf den Darm ausübt, indem es z.B. bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) eine Stabilisierung der epithelialen Barrierefunktion oder Induktion antiinflammatorischer Effekte bewirkt. Zudem besitzt Butyrat wichtige Funktionen bei der Zelldifferenzierung und der Induktion von Apoptosen. Zahlreiche Gene der Zelle werden durch Butyrat reguliert, indem es als Histon-Deacetylase-Inhibitor (HDACi) fungiert. Ziel dieser Arbeit war es, die Mechanismen des Effekts von Butyrat auf die epitheliale Barriere des Darms aufzuklären. In einem geeigneten Modell-Epithel, der humanen Kolonkarzinom- Zelllinie HT-29/B6-GR/MR, konnte gezeigt werden, dass Butyrat zeitabhängig den transepithelialen Widerstand (Rt, TER) erhöht, was auf eine Erhöhung des parazellulären Widerstandes (Rpara) zurückgeführt werden konnte. In Expressionsanalysen konnte sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene gezeigt werden, dass dieser Effekt durch die Reduktion der Expression des Tight Junction-Moleküls Claudin-2 verursacht wurde. Diese Reduktion korrelierte mit einer verminderten Na+-Permeabilität unter Butyrat, was wiederum auf die Kationenkanal-Eigenschaften von Claudin-2 zurückzuführen ist. Andere barriererelevante Claudine blieben unter dem Einfluss von Butyrat unverändert. Mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass Claudin-2 unter dem Einfluss von Butyrat zunächst aus dem Zytoplasma und anschließend aus der Tight Junction verschwand. Da die mRNA- und Protein- Stabilität von Claudin-2 unter dem Einfluss von Butyrat unverändert blieb und der Histon-Deacetylase-Inhibitor Trichostatin A ebenfalls eine Verminderung der Claudin-2-Expression induzierte, deutete dies auf eine Claudin-2-Reduktion als Folge von transkriptionellen Effekten hin. Zwar konnten keine Veränderungen der Bindung von acetyliertem Histon-3 an den Claudin-2-Promotor gezeigt werden, aber es konnte generell eine verminderte Bindung von Proteinen an verschiedenen Transkriptions-Bindestellen des Claudin-2-Promotors nachgewiesen werden. Eine wichtige Rolle konnte dabei dem für Colitis ulcerosa relevanten Transkriptionsfaktor HNF-4α zugeordnet werden, dessen Bindung an die HNF-Bindestelle im Claudin-2-Promotor durch Butyrat fast vollständig eliminiert wurde, was dafür spricht, dass HNF-4α einen wichtigen Faktor bei der Herabregulierung von Claudin-2 darstellt. Abschließend konnte in dieser Arbeit anhand eines Fallbeispiels einer Patientin mit Diversionscolitis die Relevanz dieses Mechanismus auch am nativen Darm bzw. in einer spezifischen Krankheitssituation nachgewiesen werden, indem auch hier ein Butyrat- induzierter Widerstandsanstieg in entzündeten Biopsien in direktem Zusammenhang mit einer verminderten Claudin-2-Expression stand. Die Hauptaussage dieser Arbeit ist, dass Butyrat die bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen erhöhte Expression des parazellulären Kationenkanal-Bildners Claudin-2 reduziert und es auf diese Weise zu einer Verbesserung der gestörten epithelialen Barrierefunktion des Darms kommen kann. Dieses Ergebnis unterstreicht die Wichtigkeit kurzkettiger Fettsäuren für die angeborene Immunität in Interaktion mit der Bakterienflora des Darms.

Butyrate is known to have beneficial effects on colonocytes including preservation of epithelial barrier function or anti-inflammatory influences and has also an important role in cell differentiation, apoptosis induction and gene regulation by acting as a histone deacetylase (HDAC) inhibitor. Aim of this study was to characterize the mechnisms induced by butyrate to improve the epithelial barrier function of the intestine. By means of the human colon cancer cell line HT-29/B6-GR/MR as a model, which resemble the native intestine because of its physiological properties, this study has demonstrated that butyrate treatment causes a time-dependent increase in transepthelial resistance (Rt) leading to an increase in paracellular resistance (Rpara). This was caused by the remarkable decrease of the expression of the tight junction (TJ) molecule claudin-2 which could be demonstrated on mRNA as well as on protein level by expression analysis. In addition, this finding correlated with a decrease in Na+ permeability, because claudin-2 acts as a channel for cations. Other barrier relevant claudins remained unchanged by butyrate. Confocal laser scanning fluorescence microscopy also showed that claudin-2 at first disappears from the cytoplasm of the cell and afterwards also from the tight junction in a time dependent manner in response to butyrate. The absence of butyrate effects on claudin-2 mRNA or protein stability and that the HDACi trichostatin A (TSA) also induced a decrease in claudin-2 expression indicated a decrease in claudin-2 expression which is based on transcriptional effects. While changes in binding of actylated histone 3 on claudin-2 promoter binding sites could not be found, a decrease in binding affinity of proteins to the claudin-2 promoter binding sites could be demonstrated. In this context, a main role of the ulcerative colitis relevant transcriptionfactor HNF-4α could be assigned. Thus, this study has demonstrated for the first time that HNF-4α bound the HNF binding site of the claudin-2 promoter, a process which could be completely inhibited by butyrate. This indicates that HNF-4α plays an important role in the regulation of claudin-2 in response to butyrate. The fact that biopsies from a patient with active diversion colitis showed a correlation of an increasing Rt and a decreasing claudin-2 expression after butyrate exposure in vitro underlined the relevance of these findings in our cell culture model. That butyrate can decrease the transcription of claudin-2 resulting in an improved epithelial barrier function of the intestine points to an important role of short chain fatty acids in innate immunity in interaction with the bacterial flora of the gut.