dc.contributor.author
Richter, Luise
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:08:32Z
dc.date.available
2011-12-12T14:59:33.783Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4697
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8897
dc.description.abstract
Die 42 Aminosäuren lange Form des Amyloid-β-Peptids (Aβ42) führt zum Verlust
von Synapsen und Nervenzellen und nimmt daher eine ursächliche Rolle bei der
Entstehung der Alzheimer-Krankheit ein. Dieses Peptid entsteht durch die
Prozessierung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) durch die β- und
γ-Sekretasen. Infolge des sequentiellen Proteolysemechanismus der γ-Sekretase
werden neben Aβ42 auch weitere Aβ-Spezies mit unterschiedlicher Länge
gebildet. Das β-CTF (C-terminales APP-Fragment nach erfolgter β-Sekretase-
Spaltung) dimerisiert über drei konsekutive GxxxG-Motive in der
Transmembransequenz (TMS). Die GxxxG-vermittelte Helix-Helix-Interaktion wirkt
sich dabei maßgeblich auf die sukzessive γ-Sekretase-Spaltung des β-CTF aus
und führt vermehrt zur Bildung des neurotoxischen Aβ42-Peptids. Hingegen
begünstigt eine abgeschwächte Dimerisierung, bedingt durch Punktmutationen im
zentralen GxxxG-Motiv, die Entstehung von Aβ38 und auch kürzeren Aβ-Peptiden
auf Kosten von Aβ42. Interessanterweise wurde diese reziproke Veränderung in
verschiedenen in vitro- und in vivo-Experimenten auch für niedermolekulare
Substanzen, wie Sulindac Sulfid und Indomethacin, beobachtet, die heute
klassische γ-Sekretase-Modulatoren (GSMs) darstellen. Indessen wurde der
entgegengesetzte Effekt für Fenofibrat und Celecoxib gefunden - zwei wichtige
Vertreter der inversen γ-Sekretase-Modulatoren (iGSMs). Im Rahmen dieser
Arbeit wurde erstmals der direkte Zusammenhang zwischen der Aβ-modulierenden
Wirkung klassischer GSMs sowie iGSMs und der GxxxG-vermittelten Dimerisierung
detailliert untersucht. Die direkte Interaktion von GSMs mit der Aβ-Sequenz
als mögliches molekulares Target wurde in dieser Arbeit mittels SPR-Analysen
und NMR-spektroskopischen Experimenten untersucht. Es konnte nachgewiesen
werden, dass sowohl Sulindac Sulfid und Indomethacin als auch das hochwirksame
GSM-1 direkt an die Aβ-Sequenz binden, während inaktive Sulindac-Derivate
keine spezifische Bindung zeigten. Es stellte sich heraus, dass die APP-TMS
für diese Interaktion von Bedeutung ist. Des Weiteren machten molekulare
Ligandenbindungs-Modelle deutlich, dass die flache Dimer-Kontaktfläche der
APP-TMS, gebildet aus den Glycin-Resten der drei aufeinander- folgenden GxxxG-
Motive, eine ideale Kontaktfläche für solche Aβ42-reduzierenden Substanzen
darstellt. Diese Ergebnisse unterstützen die experimentellen Daten Um den
Einfluss dieser Substanzen auf die Dimerisierung der APP-TMS in lebenden
Zellen zu analysieren, kam ein bakterieller Reportergen-basierter
Dimerisierungs-Assay zum Einsatz. Die Resultate zeigen bemerkenswerterweise,
dass die homophile Helix-Helix Interaktion der APP-TMS durch Sulindac Sulfid
und Indomethacin abgeschwächt wird, nicht jedoch durch inaktive Sulindac-
Derivate. Zudem offenbarte sich, dass GSM-1 diesbezüglich noch wirkungsvoller
war als Sulindac Sulfid. Des Weiteren wurden neuartige Sulindac-Derivate
systematisch untersucht. Beachtlicherweise konnte eine direkte Korrelation
hinsichtlich der Aβ-Modulation, der TMS-Dimerisierung und der Bindung an Aβ42
nachgewiesen werden. Es ließen sich zudem Rückschlüsse auf die Struktur-
Wirkungs-Beziehung dieser Substanzen ziehen. Bei der Analyse klassischer iGSMs
stellte sich heraus, dass weder Fenofibrat noch Celecoxib in der Lage war,
unter den verwendeten experimentellen Bedingungen an die monomere Aβ-Sequenz
zu binden. Dennoch ließ sich die Dimerisierung der APP-TMS durch Celecoxib
konzentrationsabhängig stabilisieren. Dies weist also darauf hin, dass
bestimmte iGSMs die GxxxG-vermittelte Dimerisierung entgegengesetzt zu GSMs
modulieren können. Zusammengefasst machen diese Befunde deutlich, dass
niedermolekulare Substanzen Einfluss auf die Aβ-Bildung nehmen können, indem
sie sich direkt auf die Dimerisierung der APP-TMS auswirken. Daraus erschließt
sich ein völlig neuartiger Wirkmechanismus für solche Substanzen. Diese Daten
wurden teilweise in der internationalen Fachzeitschrift »Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America« (PNAS)
veröffentlicht (Richter et al., 2010). Weitere Untersuchungen mit anderen
dimerisierenden Sequenzen legten jedoch nahe, dass die Fähigkeit von Sulindac
Sulfid und Celecoxib zur Modulation der Dimerisierung nicht allein auf die
APP-TMS beschränkt ist. Folglich besteht die Notwendigkeit, Substanzen mit
erhöhter Spezifität gegenüber der TMS von APP zu entwickeln. Das zentrale
GxxxG-Motiv in der APP-TMS spielt zudem eine wesentliche Rolle bei der
Aggregation von Aβ42 und fördert die Ausbildung neurotoxisch wirkender
Oligomere. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, den möglichen Einfluss
protektiver Aβ42-reduzierender Substanzen auf die Oligomerisierung und
Fibrillenbildung von Aβ42 zu analysieren. Zu diesem Zweck wurden
Größenausschluss-Chromatographien und elektronenmikroskopische Analysen
durchgeführt. Dabei konnte festgestellt werden, dass die Oligomerisierung von
Aβ42 in Anwesenheit von Sulindac Sulfid beschleuningt war, während die Bildung
von reifen Fibrillen maßgeblich unterdrückt wurde. Diese Ergebnisse zeigen
überzeugend, dass durch Aβ42-reduzierende Substanzen nicht nur die APP-
Prozessierung in Richtung kürzerer, nicht toxischer Aβ-Spezies verschoben
wird, sondern zudem auch eine Verschiebung der Oligomerisierung von Aβ42 hin
zu höheren, nicht toxischen Oligomeren sattfindet. Beide Eigenschaften lassen
sich dabei wohl auf die duale Rolle der GxxxG-Motive in der APP-TMS
zurückführen. Schließlich ergab sich in der vorliegenden Arbeit eine neue und
vielversprechende Strategie zur Therapie der Alzheimer-Krankheit, die neue
Möglichkeiten zur Identifizierung und Entwicklung neuartiger
Aβ42-reduzierender Substanzen mit optimierten pharmakologischen Eigenschaften
eröffnet.
de
dc.description.abstract
The 42-amino acid residue isoform of the amyloid-β peptide (Aβ42) contributing
to synaptic and neuronal loss is thought to be the main culprit in the
pathogenesis of Alzheimer’s disease. This peptide is generated by proteolytic
processing of the amyloid precursor protein (APP) by β- and γ-secretases.
Besides Aβ42 several Aβ species of variable length are produced as a result of
the sequential γ-secretase cleavage mechanism. β-CTF (C-terminal fragment of
APP after β-secretase cleavage) dimerizes via three consecutive GxxxG motifs
in its transmembrane sequence (TMS). The GxxxG-mediated helix-helix
interaction has regulatory impact on the successive γ-secretase cleavage
process, thereby leading to the increased production of the neurotoxic Aβ42
peptide. In contrast, an attenuated dimerization strength induced by point
mutations in the central GxxxG motif results in a reduced Aβ42 production in
favor of Aβ38 or even shorter Aβ peptides. Interestingly, this inverse
regulation has also been observed in numerous in vitro and in vivo studies for
small compounds, like sulindac sulfide and indomethacin, being classified as
γ-secretase modulators (GSMs). The opposite effect has been found for
fenofibrate and celecoxib, two well-known inverse γ-secretase modulators
(iGSMs). In this thesis the direct link between the Aβ-modulating effects of
GSMs and iGSMs and the GxxxG-mediated dimerization was analyzed for the first
time. The direct interaction of classical GSMs with the Aβ sequence as a
potential molecular target was examined by SPR experiments and NMR
spectroscopy. It was observed that sulindac sulfide and indomethacin as well
as the highly potent GSM-1 directly bind to the Aβ sequence, whereas all
inactive sulindac derivatives did not show specific binding. The APP-TMS was
found to be critical for this interaction. Moreover, molecular docking
analyses showed that the flat dimer interface within the APP-TMS composed of
the alternating glycine residues of the GxxxG motifs forms an ideal contact
site for Aβ42-lowering compounds, further supporting the experimental data. In
order to analyze the compounds‘ effect on APP-TMS dimerization in living cells
a bacterial reporter gene-based dimerization assay was used. Strikingly, it
was found that homophilic helix- helix interaction of the APP-TMS was
attenuated by sulindac sulfide and indomethacin, but not by inactive sulindac
derivatives. In addition, GSM-1 was found to be even more potent than sulindac
sulfide. Furthermore, novel sulindac-derived compounds were systematically
analyzed. Remarkably, the results show a tight correlation regarding Aβ
modulation, APP-TMS dimerization and Aβ42 binding, thereby drawing firm
structure-activity relationship conclusions of those compounds. When analyzing
classical iGSMs for their ability to bind to the Aβ sequence, neither
fenofibrate nor celecoxib were able to interact with monomeric Aβ under the
experimental conditions used in this study. However, dimerization of the APP-
TMS was stabilized in a dose-dependent manner by celecoxib, indicating an
inverse modulation of the GxxxG-mediated dimerization by certain iGSMs.
Collectively, these findings strongly demonstrate that small compounds affect
Aβ42 production by directly interfering with APP-TMS dimerization, thus
providing clear evidence for a new molecular mechanism of action for those
compounds. Parts of these results have been published in: PNAS - Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America (Richter
et al., 2010). Further investigations using other dimerizing sequences
revealed that the ability of sulindac sulfide and celecoxib to modulate the
dimerization strength is not necessarily restricted to the TMS of APP, though.
Accordingly, there is a need for compounds showing improved specificity for
the APP-TMS as a molecular target. Additionally, the central GxxxG motif
within the APP-TMS plays a pivotal role in early aggregation of Aβ42 and
promotes the formation of neurotoxic oligomers. A further aim was to
investigate the possible impact of potentially protective Aβ42-lowering
compounds on Aβ42 oligomerization and fibrillization. Therefore, size
exclusion chromatography and electron microscopy were performed. It was
observed that Aβ42 oligomerization was accelerated whereas fibril formation
was suppressed by sulindac sulfide. These results convincingly show that
Aβ42-lowering compounds not only shift APP processing towards shorter non-
toxic Aβ species but also shift Aβ42 oligomerization towards higher non-toxic
oligomers. Indeed, both properties can be attributed to the dual role of the
GxxxG motifs within the APP-TMS. In conclusion, in this thesis a new promising
therapeutic strategy against Alzheimer’s disease has been uncovered and opens
novel possibilities for the identification and development of new
Aβ42-lowering compounds with optimized pharmacological properties.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Einfluss niedermolekularer Substanzen auf die Homointeraktion des Amyloid-
Vorläuferproteins
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Gerd Multhaup
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Ferdinand Hucho
dc.date.accepted
2011-12-09
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000034923-5
dc.title.subtitle
Das GxxxG-Motiv als Zielstruktur für die Modulation der Bildung und
Aggregation von Aβ
dc.title.translated
Effects of small molecular compounds on homophilic interactions of the amyloid
precursor protein
en
dc.title.translatedsubtitle
The GxxxG motif as target for the modulation of Aβ production and aggregation
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000034923
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000010418
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open access