Fluoreszierende Membranspannungssensoren zur Quantifizierung des Membranpotentials der Cytochrom‐c‐ Oxidase und der Analyse von essenziellen Aminosäuren zum Aufbau des Membranpotentials

Abstract

In dieser Arbeit wird ein proteoliposomaler membranspannungssensitiver Assay mittels biophysikalischer Methoden entwickelt, charakterisiert und angewendet. Dieser Assay ermöglicht die direkte Untersuchung der Membranpotentialentwicklung von membranständigen Ionenpumpen, wie der Cytochrom-c-Oxidase. Dazu wurden einige Fluoreszenzaufbauten neu konzipiert, um diese Methoden anwenden zu können. Zur molekularen Charakterisierung des Assays wurde ein geeigneter membranständiger Spannungssensor identifiziert, hier Varianten von Archaerhodopsin-3 aus Archaebakterien. Der Mechanismus, der die Abhängigkeit der Spannungssensitivität und der Fluoreszenzänderung bewirkt, wurde mittels Absorption- und Fluoreszenztechniken untersucht. Nach Auswahl einer geeigneten Variante, Archon 1, wurde dieses Protein in Bakterien und Proteoliposomen mittels (zeitaufgelöster) Fluoreszenztechniken weiterführend charakterisiert. Anschließend wurde sein Einbau und seine Funktionsweise mittels Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie und totaler interner Reflektion Fluoreszenzmikroskopie (TIRF) im proteoliposomalen Assay untersucht, und der Mechanismus der Signalweiterleitung anhand von zwei Punktmutationen weiter untersucht. Dabei konnte der Mechanismus als statisches Quenching identifiziert werden, wahrscheinlich bedingt durch benachbarte Tryptophane. Als zu untersuchendes spannungsgenerierendes System diente die Cytochrom-c-Oxidase aus Paracoccus denitrificans. Vor der Verwendung im liposomalen Assay wurde der Einbau in Liposomen analysiert und charakterisiert. Hierzu wurde ein alternierendes Laseranregungssystem aufgebaut, um Einzelmolekül-FRET zu etablieren. Basierend auf diesen Untersuchungen konnte der Assay genutzt werden, um den Aufbau der Membranspannung durch den Protonentransport der Cytochrom-c-Oxidase zu untersuchen. Die initiale Aufnahme eines Elektrons von Cytochrom-c und der Elektronenweiterleitung an das aktive Zentrum der Cytochrom-c-Oxidase wurde mittels zeitaufgelöster Absorptionsspektroskopie untersucht. Hierfür wurde der Spektroskopie-Aufbau durch ein neues Anregungssystem und einer Erweiterung der Software verbessert, um das schwache Elektronensignal am Häm a der Cytochrom-c-Oxidase zu registrieren. Der Assay wird auf Varianten der Cytochrom-c-Oxidase angewendet, um mögliche Einwirkungen auf Protonenaufnahme und -abgabe zu untersuchen. Die Mutationsstellen dieser Varianten befinden sich an der Oberfläche der Cytochrom-c-Oxidase. Die Untersuchung von einigen Varianten zeigen ein verändertes Membranpotential im Vergleich zum Wildtyp. Ebenso wird die direkte Interaktion von Doxorubicin, einem Krebsmedikament das auch Veränderungen in der zellulären Atmungskette hervorruft, mit Cytochrom-c-Oxidase zum ersten Mal identifiziert. Ich konnte hierbei die Veränderung der generierten Membranspannung bedingt durch Mutationen und Inhibitor zeigen und mögliche zugrunde liegende Mechanismen der Funktionalität aufzeigen.