The location of proteins inside the cell is a key determinant for the availability of binding partners, cofactors, and substrates. Characterizing protein subcellular localizations, thus, reveals important aspects of protein functions. These functional insights can enhance our knowledge of the distinct biological roles played by different compartments within a cell. Elucidating such mechanistic details in a global and systematic manner is the central aim of spatial proteomics. A variety of microscopy and mass spectrometry-based techniques have been applied for spatial proteomics studies. However, existing methods lack the resolution, throughput, and efficiency to systematically study sub-organelle and membrane-associated proteomes as well as membrane protein topologies. In this thesis, I developed the concept of cross-link assisted spatial proteomics (CLASP) to address the above shortcomings. CLASP allows extracting spatial information from cross-linking mass spectrometry (XL-MS) data. Using mitochondria from human cells as a model system, I demonstrated the ability of CLASP to characterize the spatial proteomes across all mitochondrial sub-compartments, discover new mitochondrial-associated proteins, and reveal the topology of the mitochondrial membrane proteome. I verified 9 spatial annotations derived from CLASP through biochemical and imaging methods, confirming the validity of the CLASP analysis. Furthermore, I showed that different experimental XL-MS workflows yield highly similar CLASP annotations, confirming the high reproducibility and robustness of CLASP. Finally, the versatility and usability of CLASP was increased by implementing the cross-link visualization application XlinkCyNET and a Python-based CLASP automation tool. Collectively, the results of this thesis broaden the application scope of XL-MS beyond its conventional uses in the characterization of protein interactions, structures, and conformations. They establish XL-MS as a spatial proteomics technique and CLASP as the first approach for simultaneously profiling sub-organellar proteomes and membrane protein topology.
Der Ort, an dem sich Proteine in einer Zelle befinden, ist ein entscheidender Faktor für die Verfügbarkeit von Bindungspartnern, Kofaktoren und Substraten. Die Charakterisierung der subzellulären Lokalisierung von Proteinen offenbart daher wichtige Aspekte der Proteinfunktionen. Diese funktionellen Erkenntnisse können zu unserem Wissen über die unterschiedlichen biologischen Rollen verschiedener Kompartimente innerhalb einer Zelle beitragen. Das zentrale Ziel der ortsaufgelösten Proteomik ist es, solche mechanistischen Details auf globale und systematische Weise aufzuklären. Eine Vielzahl von mikroskopischen und massenspektrometrischen Techniken wurde bereits für ortsaufgelöste Proteomikstudien eingesetzt. Den vorhandenen Methoden mangelt es jedoch an Auflösung, Durchsatz und Effizienz, um systematisch suborganellare und membranassoziierte Proteome sowie Membranproteintopologien zu untersuchen. Im Rahmen dieser Dissertation habe ich das Konzept der vernetzungsgestützten ortsaufgelösten Proteomik (“cross-link assisted spatial Proteomics”, CLASP) entwickelt, um die oben genannten Defizite zu beheben. CLASP ermöglicht die Extraktion räumlicher Informationen aus mittels Quervernetzung-Massenspektrometrie (“cross-linking mass spectrometry”, XL-MS) generierter Daten. Unter Verwedung von Mitochondrien aus humaner Zellkultur als Modellsystem, habe ich die Fähigkeit von CLASP gezeigt, räumlichen Proteome aller mitochondrialen Subkompartimente zzu charakterisieren, neue mitochondrienassoziierte Proteine zu entdecken und die Topologie des mitochondrialen Membranproteoms aufzudecken. Ich habe 9 räumliche Annotationen, die aus CLASP abgeleitet wurden, durch biochemische und mikroskopische Methoden verifiziert und damit die Korrektheit der CLASP-Analyse bestätigt. Darüber hinaus habe ich gezeigt, dass verschiedene experimentelle XL-MS-Arbeitsabläufe sehr ähnliche CLASP-Annotationen liefern, was die hohe Reproduzierbarkeit und Robustheit von CLASP bestätigt. Schließlich wurde die Vielseitigkeit und Benutzerfreundlichkeit von CLASP durch die Implementierung der Cross-Link-Visualisierungssoftware XlinkCyNET und einer Python-basierten Anwendung zur CLASP-Automatisierung erhöht. Insgesamt erweitern die Ergebnisse dieser Dissertation den Anwendungsbereich von XL-MS über die konventionellen Einsatzmöglichkeiten in der Charakterisierung von Proteininteraktionen, -strukturen und -konformationen hinaus. Sie etablieren XL-MS als eine Methode für ortsaufgelöste Proteomik und CLASP als den ersten Ansatz für die gleichzeitige Charakterisierung suborganellarer Proteome und der Topologie von Membranproteinen.
