Extracellular miR-100-5p and miR-298-5p: Novel Toll-like Receptor 7 and 8 Ligands and Facilitators of Neuroinflammation and Neurodegeneration

Abstract

Neurodegenerative diseases are characterized by a viscous circle of neurodegeneration and neuroinflammation. Apoptotic neurons release small molecules which potentially ac- tivate receptors of the innate immune system. Activated immune cells create a proinflam- matory milieu, exacerbating neuronal damage and thereby releasing more potential en- dogenous ligands into the extracellular space. Extracellular microRNA (miRNA) signa- tures are dysregulated in numerous neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease, and some miRNAs activate the endosomal Toll-like receptors 7 and 8 (TLR7/8). I hypothesized that miRNAs released by apoptotic neurons act as signaling molecules in apoptosis. Some of these miRNAs might activate TLR7 and 8 in microglia and neurons, thus exacerbating the vicious circle of neurodegeneration and neuroinflammation. Six miRNA which had been shown to be released by apoptotic neurons in a prior Micro- Array assay activated TLR7 and/ or TLR8 in a HEK-Blue reporter cell line. Among these were miR-100-5p and miR-298-5p, which are dysregulated in Alzheimer’s disease. A bi- oinformatic search strategy revealed that miRNA-induced TLR7 and 8 activation was se- quence-, but not structure-specific. Dependent on TLR7, miR-100-5p and miR-298-5p stimulated microglia to release a complex pattern of neuroinflammatory molecules which were detected via Multiplex assay. Both microglia and cortical neurons transported extra- cellular fluorescently labeled miR-100-5p and miR-298-5p to their endosomes, where the miRNAs co-localized with TLR7. miR-100-5p and miR-298-5p induced cell-autonomous neuronal apoptosis in vitro. In vivo, miR-100-5p and miR-298-5p introduced into the cer- ebrospinal fluid via intrathecal injection facilitated TLR7-dependent neurodegeneration and accumulation of microglia, which was enhanced in a neuroinflammatory environment. In conclusion, miR-100-5p and miR-298-5p, which are released by neurons undergoing apoptosis, act as specific, immunomodulatory signaling molecules. They contribute to the vicious circle of neurodegeneration by inducing neuroinflammation and cell-autonomous neuronal apoptosis. This study illuminates the role miR-100-5p and miR-298-5p, both potential biomarkers, play in the pathophysiology of neurodegenerative diseases. As fa- cilitators of neurodegeneration, both are interesting candidates for future therapeutic interventions.

Bei neurodegenerativen Erkrankungen spielt sich ein verheerender Teufelskreis der Neu- rodegeneration und Neuroinflammation ab. Apoptotische Neurone schütten Moleküle aus, die das angeborene Immunsystem aktivieren. Auf diese Art aktivierte Immunzellen schaffen durch die Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen ein proinflammato- risches Milieu, welches seinerseits Neurone schädigt. Der Teufelskreis schließt sich durch die Ausschüttung weiterer inflammatorischer Moleküle durch die geschädigten Neurone. In vielen neurodegenerativen Erkrankungen, unter anderem bei Morbus Alz- heimer, ist die microRNA- Signatur in extrazellulären Flüssigkeiten dysreguliert. Einige miRNA aktivieren die endosomalen Toll-like Rezeptoren 7 und 8 (TLR7/8). Ich habe die Hypothese aufgestellt, dass microRNA (miRNA) als spezifische immunmod- ulatorische Signalmoleküle der Apoptose fungieren. Diese miRNAs aktivieren TLR7 oder 8 in Mikroglia und Neuronen. Sie entfachen dadurch den Teufelskreis aus Neuroinflamma- tion und Neurodegeneration. Sechs der evaluierten miRNAs, die durch apoptotische Neurone freigesetzt wurden, ak- tivierten TLR7 und/ oder 8 in HEK-Blue Reporter Zellen. Unter anderem aktivieren miR- 100-5p und miR-298-5p, die bei Morbus Alzheimer fehlreguliert sind, TLR7/8. Eine bioin- formatische Suchstrategie ergab, dass die TLR7/ 8 Aktivierung sequenz- aber nicht strukturspezifisch ist. Nur TLR7 exprimierende Mikroglia setzten nach Stimulation mit miR-100-5p und miR-298-5p ein komplexes Muster an neuroinflammatorischen Molekülen frei, das via Multiplex Assay detektiert wurde. Sowohl Mikroglia als auch kortikale Neurone transportierten extrazelluläre, fluoreszent markierte miR-100-5p und miR-298-5p in ihre Endosomen, wo die miRNA mit TLR7 ko-lokalisierte. miR-100-5p und miR-298-5p lösten beide zell-autonome neuronale Apoptose in vitro aus. In vivo, verursachten miR-100-5p und miR-298-5p, die intrathekal in den Liquor cerebrospinalis injiziert wurden, TLR7 abhängige Neurodegeneration und mikrogliale Akkumulation aus, die durch ein neuroinflammatorisches Milieu exazerbiert wurde. Zusammenfassend fungieren miR-100-5p und miR-298-5p als spezifische, immunmodu- latorische Signalmoleküle für TLR7. Sie tragen zum Teufelskreis der Neurodegeneration bei, indem sie Neuroinflammation und zell-autonome neuronale Apoptose induzieren. Diese Studie zeigt eine pathophysiologische Rolle für miR-100-5p und miR-298-5p, die beide als Biomarker in Frage kommen, in neurodegenerativen Erkrankungen auf. Beide stellen interessante Kandidaten für zukünftige therapeutische Strategien dar.