The combined parts of this thesis aimed to elucidate the transition mechanisms of thermoresponsive glycerol-based polymers and utilize these insights to establish a robust platform for the fabrication of thermally detached cell sheets. Conclusions from temperature-dependent studies of PGE and PGE-like alkoxy hydroxypropyl [meth]acrylate (AHP[M]A) polymers led to a PEHPA-based brush coating for cell sheet fabrication. A comparison of PGE and PEHPA brush coating properties and cell harvesting performance before and after sterilization highlighted the upside of the newly developed PEHPA polymer design. The phase transition behavior of thin brush layers with transition temperatures below the physiological range was studied using 10 and 22 kDa PGE chains, which were immobilized on inert gold surfaces by precedingly introduced thiol anchor blocks. Optimized grafting procedures were adapted to obtain molecular control of brush properties with dry thicknesses of 1.6 – 10 nm and grafting densities of 0.07 – 0.5 chains nm-2. Remarkably, similar transition temperatures in solution and on surface were detected between 26 and 31 °C and attributed to the non-interacting gold surface, which does not affect the reversible transition process. However, the phase transition concluded between 35 and 40 °C, which could hamper effective cell attachment due to remaining coating hydration and should be considered when designing cell-adhesive functional surfaces. Furthermore, the phase transition mechanism of surface-tethered PGE chains was found to be primarily dependent on the grafting density. Low GD regimes (0.07 – 0.12 chains nm-2) exhibited a brush-to-mushroom transition with parallel chain dehydration and collapse processes. In contrast, middle GD regimes (0.3 – 0.5 chains nm-2) displayed a brush-to-brush transition, with initially more distinct dehydration and a more pronounced brush collapse after water molecules were expelled. In the following study, AHP[M]A monomers were derived through molecular design, to establish an alternative to PGE polymers. The design featured PGE-like short alkoxy side chains for similar functionality and hydroxy groups to balance the hydrophobic aliphatic backbone. Polymerization under optimized RAFT conditions yielded narrow dispersed 22-25 kDa polymers. Subsequent phase transition studies of 20 – 5 mg mL-1 concentrated aqueous solutions of PHMPMA, PEHPA and PEHPMA revealed transition temperatures of 37 – 43 °C, 22 – 25 °C, and 8 – 10 °C, respectively. The increase in side-chain hydrophobicity from a methoxy to an ethoxy group resulted in less concentration- and molecular weight-dependent cloud point temperatures, particularly in the comparison of isomeric PHMPMA and PEHPA polymers, where a methyl group was “shifted” from the PHMPMA backbone to the end of the PEHPA side chain through molecular monomer design. Furthermore, NMR spectra of PHMPMA in deuterated water did not reveal any chain dehydration, indicating an LLPS transition type. In contrast, a distinct dehydration of all PEHP[M]A chain parts was observed in temperature-dependent NMR spectra after passing the cloud point temperature, indicating a pronounced CTG behavior which is an important precondition for cell harvesting coatings. The conclusions from PGE brush studies revealed the concordance of transition temperatures of solutions and thin brush layers, as well as the possible impact of broad transition ranges. Keeping that in mind, PEHPA and PEHPMA polymers with CTG transition type and sufficiently low Tcp values in solution were chosen for the preparation of coatings for cell sheet fabrication on applicable hydrophobic PS surfaces. An immobilization strategy through self-assembly, directed by a short (2 – 4 repeating units) hydrophobic benzophenone (meth)acrylate block (BP), copolymerized to the homopolymer chains, was transferred from previous PGE reports. Layers of surface tethered 22 – 24 kDa PEHP[M]A-BP polymers with thicknesses up to ~3 nm were obtained after UV irradiation, which induced a covalent crosslinking reaction between BP and PS, followed by layer extraction. Protein adsorption on these brush surfaces was an order of magnitude lower compared to TCPS surfaces (20 – 90 ng cm-2 and 800 ng cm-2, respectively) under cell culture conditions (37 °C), which is typically linked with cell-repellent surfaces. Nevertheless, both polymer coatings enabled the adhesion, proliferation and detachment of human dermal fibroblasts. PEHPA-BP brushes reliably detached cell sheets after cooling to room temperature, whereas PEHPMA-BP surfaces required cooling to 4 °C and performed less reliably, sometimes resulting in sheet fragmentation. Consequently, DIN normed sterilization with formaldehyde gas or gamma radiation were performed with PEHPA-BP coatings and previously established PGE brush coatings on PS and TCPS substrates. Gamma sterilization with a dose of 45 kGy degraded PGE brush coatings and significantly altered the properties of PEHPA-BP brush coatings, rendering them unable to detach cell sheets post-sterilization. In contrast, FO gas treatment had no adverse effects on the brush coatings. However, after the timeframe of sterilization and transport processes (14 – 18 d), the thickness of PGE brush coatings, irrespective of FO sterilization, decreased significantly, possibly due to a drying effect of the brush layer. At the same time, no changes were detected for PEHPA-BP brushes. Consequently, detachment times on PGE brushes increased markedly from 60 to a maximum of 180 min. Only a slight increase was observed on PEHPA-BP brushes, from 60 to 90 min maximum time, showing the advantage of the new polymer design. In conclusion, thermoresponsive PHMPMA, PEHPA and PEHPMA polymers were established through molecular design, inspired through PGE structures. The investigation of the phase transition in solution, combined with insights from phase transition studies of PGE brush layers, were used to select PEHPA and PEHPMA polymers for designing functional coatings for cell sheet fabrication. The CTG transition-type polymers supported cell proliferation and detachment and PEHPA-based coatings exhibited enhanced durability. These findings highlight the benefit of the aliphatic backbone, compared to polyether-based PGE coatings.
Die vereinten Abschnitte dieser Arbeit hatten zum Ziel, die Übergangsmechanismen von glycerinbasierten, thermoresponsiven Polymeren aufzuklären und diese Erkenntnisse zu nutzen, um eine robuste Plattform für die Herstellung thermisch ablösbarer Zellmonlagen zu etablieren. Erkenntnisse aus temperaturabhängigen Studien von PGE- und PGE-ähnlichen Alkoxyhydroxypropyl[meth]acrylat (AHP[M]A)-Polymeren führten zu einer PEHPA-basierten Bürstenbeschichtung für das Ablösen von Zellmonolagen. Ein Vergleich der PGE- und PEHPA-Bürstenbeschichtungen hinsichtlich ihrer Eigenschaften und der Zellablöseprozedur vor und nach der Sterilisation zeigte die positiven Auswirkungen des alternativen Polymerdesigns. Das Phasenübergangsverhalten dünner Bürstenschichten mit Übergangstemperaturen unterhalb des physiologischen Bereichs wurde untersucht mithilfe von 10 und 22 kDa schweren PGE-Ketten, die auf inerten Goldoberflächen durch zuvor eingebaute Thiol-Ankerblöcke immobilisiert wurden. Optimierte Adsorptionsverfahren wurden übernommen, um Bürstenparameter auf molekular Ebene einzustellen und Trockenschichtdicken von 1,6 – 10 nm, sowie Kettendichten (KD) von 0,07 – 0,5 Ketten nm-2 zu erhalten. Bemerkenswerterweise stimmten die Übergangstemperaturen im Bereich zwischen 26 und 31 °C jeweils in der Lösung und auf der Oberfläche überein. Dies wurde auf die nicht mit Polymeren wechselwirkende Goldoberfläche zurückgeführt, die den reversiblen Phasenübergangsprozess nicht beeinflusste. Der Phasenübergang endete jedoch zwischen 35 und 40 °C, was eine effektive Zellanhaftung aufgrund der verbleibenden Hydratation behindern könnte und bei der Entwicklung von funktionellen zelladhäsiven Oberflächen berücksichtigt werden sollte. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der Phasenübergangs-mechanismus der gebundenen PGE-Ketten wesentlich von der KD abhängt. Niedrige KD-Bereiche von 0,07 – 0,12 Ketten nm-2 zeigten einen Bürste-Pilzhut-Übergang mit paralleler Dehydratisierung und Kollaps der Ketten. Im Gegensatz dazu zeigten mittlere KD-Bereiche von 0,3 – 0,5 Ketten nm-2 einen Bürste-Bürste-Übergang mit einer prägnanten Dehydratisierung zu Beginn und folgend mehr sichtbaren Ketten-Kollaps, der durch die abwesenden Wassermoleküle ermöglicht wird. In der folgenden Studie wurden AHP[M]A-Monomere durch molekulares Design abgeleitet, um eine Alternative zu PGE-Polymeren zu etablieren. Das Design enthielt PGE-ähnliche kurze Alkoxy-Seitenketten für eine ähnliche Funktionalität und Hydroxygruppen zum Ausgleich des hydrophoben aliphatischen Rückgrats. Die Polymerisation unter optimierten RAFT-Bedingungen ergab 22-25 kDa schwere Polymere mit enger Mokelurargewichtsverteilung. Anschließende Phasenübergangsstudien von 20 – 5 mg mL-1 konzentrierten wässrigen Lösungen von PHMPMA, PEHPA und PEHPMA ergaben Übergangsbereiche von jeweils 37 – 43 °C, 22 – 25 °C und 8 – 10 °C. Die Erhöhung der Hydrophobie in der Seitenkette von einer Methoxy- zu einer Ethoxygruppe führte zu einer geringeren Abhängigkeit der Schaltpunkte von Konzentration und Molekulargewicht, insbesondere beim Vergleich der isomeren PHMPMA- und PEHPA-Polymere, bei denen eine Methylgruppe vom PHMPMA-Rückgrat zum Ende der PEHPA-Seitenkette durch molekulares Monomerdesign "verschoben" wurde. Zudem zeigten die NMR-Spektren von PHMPMA in deuteriertem Wasser keine Dehydratisierung von Polymerketten, was auf einen sogenannten „LLPS“-Übergangstyp hindeutet. Im Gegensatz dazu wurde in temperaturabhängigen NMR-Spektren von PEHP[M]A Lösungen nach Überschreiten der Schalttemperatur eine deutliche Dehydratisierung aller Kettenteile beobachtet. Dies deutet auf ein Knäuel-Globuli (KG) hin, eine wichtige Voraussetzung für temperaturabhängige Beschichtungen für Zellablösevorgänge. Die Erkenntnisse aus der Untersuchung der PGE-Bürsten ergaben die Übereinstimmung der Übergangstemperaturen in Lösung und auf der Oberfläche, sowie den möglichen Einfluss des breiten Übergangsbereichs. Dementsprechend wurden PEHPA- und PEHPMA-Polymere mit ausreichend tiefen Schaltwerten in Lösung und dem KG-Übergangstyp für die Entwicklung von Beschichtungen auf gängigen hydrophoben PS-Oberflächen für das Ablösen von Zellmonolagen ausgewählt. Eine Immobilisierungsstrategie basierend auf PGE-Bürstenschichten wurde übernommen, indem gezielte Adsorption durch einen zuvor eingeführten, kurzen (2-4 Einheiten), hydrophoben Benzophenon(meth)acrylat-Block (BP) gesteuert wurde. Schichten aus oberflächen-gebundenen 22 – 24 kDa schweren PEHPA BP und PEHPMA-BP Polymeren mit Dicken von bis zu ~3 nm wurden nach der Vernetzung von BP mit PS durch UV-Bestrahlung und anschließender Oberflächenextraktion erhalten. Überraschenderweise war die Proteinadsorption auf diesen Bürstenoberflächen bei 37 °C um eine Größenordnung geringer als auf TCPS (20 – 90 ng cm-2 und 800 ng cm-2), was im Allgemeinen eher bei zellabweisenden Oberflächen beobachtet wird. Dennoch gelangen sowohl die Kultivierung als auch das Ablösen von humanen dermalen Fibroblast-Monolagen, wobei sich die Zellen von PEHPA-BP-Oberflächen nach Abkühlung auf Raumtemperatur zuverlässig ablösten, während bei PEHPMA-BP-Oberflächen eine Abkühlung auf 4 °C erforderlich war und das Ablösen teils nicht in Monolagen erfolgte. Daher wurden PEHPA-BP-Beschichtungen und zuvor etablierte PGE-Bürstenbeschichtungen auf PS- und TCPS-Substraten einer DIN-genormten Sterilisation durch Formaldehydgas oder Gammabestrahlung unterzogen. Gammasterilisation mit einer 45 kGy Dosis führte dabei zur Degradation der PGE-Beschichtungen und modifizierte die PEHPA-BP Eigenschaften derart, dass nach der Sterilisation kein zuverlässiges Ablösen der Zellen gewährleistet war. FO-Gas hingegen zeigte keine Auswirkungen auf die Bürstenbeschichtungen. Allerdings nahm die Dicke der PGE-Bürstenbeschichtungen nach dem Zeitrahmen der Sterilisations- und Transportprozesse (14 - 18 d) unabhängig von der FO-Sterilisation ab, was mutmaßlich ein langfristiger Trocknungseffekt der Bürstenschicht ist. Gleichzeitig wurden bei PEHPA-BP-Bürsten keine Veränderungen festgestellt. Die Ablöseszeiten auf PGE-Bürsten stiegen deutlich von 60 Minuten auf maximal 180 Minuten an. Bei PEHPA-BP-Bürsten wurde nur ein leichter Anstieg von 60 auf 90 Minuten beobachtet, was den Vorteil des neuen Polymerdesigns nahelegt. Zusammenfassend, wurden thermoresponsive PHMPMA-, PEHPA- und PEHPMA-Polymere durch molekulares Design entwickelt, inspiriert durch PGE-Strukturen. Die detaillierte Studie des Phasenübergangs in Lösung, kombiniert mit Erkenntnissen aus Phasenübergangsstudien von PGE-Bürstenschichten, wurde genutzt, um PEHPA- und PEHPMA-Polymere für die Entwicklung funktioneller Beschichtungen zum Ablösen von Zellmonolagen zu identifizieren. Die Polymere mit dem KG-Übergangstyp unterstützten sowohl Zellwachstum als auch -ablöse. Beschichtungen auf PEHPA-Basis wiesen zudem eine erhöhte Haltbarkeit auf. Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse den Vorteil des aliphatischen Polymerrückgrats im Vergleich zu PGE-Beschichtungen auf Polyetherbasis.
