dc.contributor.author
Kotnik, Katarina
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:03:48Z
dc.date.available
2008-08-06T08:12:03.479Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4602
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8802
dc.description.abstract
The lack of germline-competent ES cells makes gene inactivation through
homologous recombination impossible in the rat. The main goal of this thesis
was to solve this problem by establishing a new gene down regulation
technology using shRNA, a natural phenomenon and a powerful tool for gene
knockdown in mammalian cells and mice. Three DNA constructs harbouring hairpin
cassettes against the EGFP gene and controlled by the U6 promoter were
generated. After standard pronuclear microinjection into zygotes of EGFP
transgenic rats more than three hundred rats were born. Surprisingly, only one
animal was found to carry the construct integrated into the genome. No GFP
silencing was observed in this transgenic founder nor was any shRNA expression
detectable. Even the use of BAC constructs based on the mouse Rosa26 locus to
achieve single transgene integration did not result in successful generation
of shRNA transgenic rats. Suspecting embryo-toxicity by abundant production of
shRNA molecules an in vitro study was carried out. By assaying embryonic
development and survival rate of rat and mouse embryos after introduction of a
hairpin construct it was shown that shRNA expression does not disturb
embryonic development at early preimplantation stages. Consequently, the
problem may appear later during pregnancy. Since pronuclear microinjection of
ubiquitously and permanently active shRNA constructs does not work in the rat
as shown in this thesis, a novel strategy to achieve conditional gene
knockdown was tested. For this purpose, a tetracycline activatable system was
used to control the expression of shRNA against the insulin receptor (InsR),
resulting in an inducible model of insulin resistance. Consequently, an
inducible and chronic model of type II diabetes including several hallmarks of
this disease was established. In addition, a novel inducible expression system
for shRNA was developed using a ligand-dependent chimeric transcription
factor. As demonstrated in cell culture, a mutated TATA-binding protein (mTBP)
activates a U6 promoter with a corresponding TATA box mutation. The fusion of
a mutated ligand binding domain of an estrogen receptor to the mTBP leads to a
chimeric protein. The translocation of the fusion protein into the nucleus
should depend on the presence of tamoxifen. However, this ligand-inducibility
of the mTBP could not be achieved in this thesis. In conclusion, with the use
of the doxycycline inducible shRNA expression system, time and/or dose
dependent gene inhibition in rats becomes possible. This flexible gene
manipulation strategy in the preferred animal model for physiopathological
studies may provide a powerful tool for the understanding of gene function.
de
dc.description.abstract
Durch das Fehlen Keimzell-kompetenter embryonaler Stammzellen in der Ratte ist
die Geninaktivierung durch homologe Rekombination nicht möglich. Das Hauptziel
dieser Arbeit war es, dieses Problem durch die Etablierung einer neuen
Technologie zum Herunterregulieren von Genen durch Nutzung von shRNA zu lösen,
einem natürlichen Phänomen und einem Werkzeug zum Ausschalten von Genen in
Säugerzellen und in Mäusen. Es wurden drei DNA-Konstrukte generiert, die
Hairpin-Kassetten gegen das EGFP-Gen beinhalteten und unter der Kontrolle des
U6-Promotors standen. Nach einer standardmäßigen pronukleären Mikroinjektion
in Zygoten von EGFP-transgenen Ratten wurden mehr als dreihundert Ratten
geboren. Überraschenderweise hatte nur ein Tier das Konstrukt in das Genom
integriert. In diesem transgenen Founder wurde weder GFP-Silencing beobachtet
noch war shRNA- Expression nachweisbar. Sogar die Nutzung eines BAC-Konstrukts
basierend auf dem Rosa26-Lokus der Maus, um eine einzelne transgene
Integration zu erreichen, resultierte nicht in der erfolgreichen Generierung
von shRNA-transgenen Ratten. Aufgrund einer vermuteten Embryo-Toxizität durch
die starke Produktion von shRNA-Molekülen sein könnte, wurde eine in vitro
Studie durchgeführt. Die Untersuchungen der embryonalen Entwicklung und die
Überlebensrate von Ratten- und Mäuseembryos nach der Injektion eines Hairpin-
Konstrukts bewiesen, dass die Expression der shRNA die embryonale Entwicklung
im frühen Präimplantations-Stadium nicht stört. Folglich sollte das Problem
später in der Schwangerschaft auftreten. Wie in der vorliegenden Arbeit
gezeigt wurde, funktioniert die pronukleäre Mikroinjektion ubiquitär und
dauerhaft aktiver shRNA-Konstrukte in der Ratte nicht. Deshalb wurde eine neue
Strategie getestet, um eine konditionelle Gen-Ausschaltung zu erreichen. Für
dieses Vorhaben wurde ein durch Tetrazyklin aktivierbares System benutzt,
welches die Expression von shRNA gegen das Gen für den Insulin Receptor (InsR)
kontrolliert, woraus ein induzierbares Model der Insulinresistenz resultierte.
Somit war ein induzierbares und chronisches Modell für Typ II Diabetes
etabliert, das verschiedene Merkmale dieser Krankheit aufwies. Zusätzlich
wurde mit Hilfe eines Liganden-abhängigen chimären Transkriptionsfaktors ein
neues induzierbares Expressionssystem für shRNA entwickelt. In
Zellkulturversuchen wurde gezeigt, dass ein mutiertes TATA-bindendes Protein
(mTBP) einen U6 Promotor mit einer entsprechenden TATA-Box-Mutation aktiviert.
Die Fusion einer mutierten Liganden-Bindungsdomäne eines Estrogenrezeptors mit
dem mTBP führt zu einem chimären Protein. Die Translokation des
Fusionsproteins in den Nukleus sollte von der Anwesenheit von Tamoxifen
abhängig sein. Jedoch konnte diese Liganden- Induzierbarkeit des mTBP in
dieser Arbeit nicht gezeigt werden. Zusammenfassend ist zu sagen, dass die
Zeit und/oder Dosis abhängige Gen- Inhibierung in Ratten durch die Nutzung des
Doxycyclin induzierbaren shRNA Systems möglich ist. Diese flexible
Genmanipulationsstrategie in dem bevorzugten Tiermodell für
physiopathologische Studien kann ein starkes Werkzeug für das Verständnis von
Genfunktionen werden.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Gene knockdown
dc.subject
transgenic rats
dc.subject
insulin receptor
dc.subject
type 2 diabetes mellitus
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Gene knockdown in transgenic rats by shRNA technology
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Michael Bader
dc.date.accepted
2008-07-25
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000004727-6
dc.title.translated
Geninaktivierung in transgenen Ratten durch die shRNA Technologie
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000004727
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000004202
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access