Stressabhängige Regulation von Proliferation und Apoptose unterschiedlicher Melanozytenpopulationen im murinen Haarfollikel: ein Modell zur Erforschung der Prämaturen Canities

Abstract

In der vorliegenden Arbeit werden die bisherigen Untersuchungen zum Ergrauen und der Melanozytenbiologie um die Fragestellung des Einflusses psycho- emotionalen Stress’ auf die Proliferation und Apoptose von Melanozyten und die Integrität der pigment-bildenden Einheit des Haarfollikels erweitert. Vor dem Hintergrund des gut erforschten Haarzyklus und den damit gekoppelten Entwicklungsstufen follikulärer Melanozyten sowie neuerer Erkenntnisse über den Zusammenhang zwischen der Akkumulation von oxidativem Stress und Haarergrauen, wurde ein etabliertes murines Stressmodell zur Simulation systemisch wahrgenommenen psycho-emotionalen Stress verwandt. In diesem Modell werden C57BL/6- und CBA/J-Mäuse für die Dauer von 24 Stunden einem Lärmstressor ausgesetzt oder erhalten eine Injektion mit dem Neuropeptide und Stressmediator Substanz P (SP) während eines durch Depilation induzierten eng umschriebenen Zeitfensters im murinen Haarzyklus. Einmal zur Etablierung der pigment-bildenden Einheit im frühen Anagen und zu Beginn der Regression am Übergang vom Anagen zum Katagen. Zusätzlich wurden Tiere in der Ruhephase (Telogen) stressexponiert, um dessen Effekte auf Transkriptionsebene zu untersuchen. Mit immunhistologischen melanozytenspezifischen Markern in Kombination mit c-kit, zur Erfassung der Aktivität und dem TUNEL-Label zur Apoptosedetektion, wurde die Rückenhaut der Tiere untersucht. Aus der Rückenhaut der Telogentiere wurde die totale RNA isoliert und zur Analyse einer Microarray zugeführt. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass SP- Applikation zum Absterben differenzierter Melanozyten im frühen Anagen führt, während Zellen der Vorläuferregion vermehrt aktiviert werden. Hierbei kommt es nicht zu einer vorzeitigen Progression des Haarzyklus, er bleibt von der akuten Stressapplikation unbeeinflusst. Im Anagen-Katagen-Übergang sterben unter Stresseinwirkung vermehrt Melanozyten ab. Diese Effekte sind durch Substanz P reproduzierbar, jedoch durch Blockierung des NK-1 Rezeptors nicht vollständig zu verhindern. Auf Transkriptionsebene werden im proliferations- und apoptosearmen Telogenstadium durch Stressexposition melanozytenrelevante Gene, die reife und undifferenzierte Melanozyten repräsentieren, induziert. Die durch Stress induzierten Signalwege scheinen überwiegend Teilbereiche einer kutanen Entzündung unter der Beteilung von Adipozyten wiederzuspiegeln. Diese inflammatorischen Prozesse schaffen einerseits ein Melanozyten- feindliches Milieu durch Generation zusätzlichen oxidativen Stress, andererseits wirken einzelne Zytokine direkt anti-proliferativ auf die Melanozyten. Die Apoptose von differenzierten Bulbusmelanozyten im frühen Anagen und die gleichzeitige Aktivierung undifferenzierter melanozytärer Stammzellen in der Isthmus- und Wulstregion sowie die vermehrte Apoptose im Anagen-Katagen-Übergang unter Stress und Substanz P bedeutet, dass diese apoptotischen Zellen dem Gesamtpool der melanozytären Zellen verloren gehen. In Verbindung mit der Beeinflussbarkeit pigmentierungsrelevanter Gene durch Stress und der Involvierung möglicher alternativer Signalwege des Stressmediators Substanz P, deutet dies daraufhin, dass es zu einem erhöhten Durchsatz an Pigmentzellen unter Stress kommt, welcher in der Folge zu einer vorzeitigen Erschöpfung des melanozytären Stammzellpools führen kann.

This work shall expand the knowledge about hair follicle melanocyte biology concerning the graying process and investigate the influence of psycho- emotional stressors on melanocyte proliferation and biology as well as on the integrity on the hair follicle pigmentary-unit. Based on defined steps of melanocyte development during the intensely researched hair cycle and complemented by findings of accumulation of oxidative stress in the context of senile graying in humans a well-established animal sonic stress model was used to simulate systemic psycho-emotional stress. In this model C57BL/6- and CBA/J-mice were exposed to a sonic stressor for 24 hours or received an injection of neuropeptide and stress mediator substance P (SP) to sharpely defined time points during depilation induced murine hair cycle, first at the establishment of the hair follicle pigmentary-unit during early anagen and second at the regression onset during anagen-catagen-transition. Additionally, animals were stress exposed during quiescence stage (teleogen) to investigate stress effects on transcriptional level. Animal back skin was investigated using immunohistochemistry. We combined melanocyte-specific markers and c-kit to monitor activity and TUNEL-labelling for apoptosis detection. From telogen mice back skin total RNA was isolated for microarray analysis. In summary we observed apoptosis of differentiated bulbar melanocytes and increased number of melanocyte precursors in the bulge region after SP-application during early anagen. We did not see any premature hair cycle stage development under acute stress application. Further, melanocyte apoptosis increased during anagen- catagen-transition under stress exposure. These effects can be mimicked by SP application, but are not completely reversible by substance P anti-NK-1 receptor antagonist. On transcriptional level of proliferation and apoptosis lacking telogen we found regulation of melanocyte-specific genes, which represent mature and undifferentiated melanocytes by stress exposure. Regulated signalling pathways seem to reflect parts of cutaneous inflammation with participation of adipocytes. This inflammatory milieu creates a melanocyte hostility by generation of oxidative stress and provides melanocytes anti-proliferative cytokines. Apoptosis of differentiated bulbar melanocytes and activation of melanocyte precursors in the bulge region during early anagen in combination with increased melanocyte apoptosis during anagen- catagen-transition under stress and SP, so may lead to a loss of melanocytes from the total melanocyte cell pool. Combined with the influence on pigmentary relevant genes and involvement of putative alternative signalling pathways, this points at an increased melanocyte throughput under stress, that may lead to a premature exhaustion of melanocyte stem cell pool.