Septin 9 (SEPT9) negatively regulates ubiquitin-dependent downregulation of epidermal growth factor receptor (EGFR)

Abstract

Septins constitute a family of GTP-binding proteins that are involved in a broad range of cellular processes including membrane trafficking, cell division and motility. By associating with membranes they form diffusion barriers to create distinct cellular domains, which serve as scaffolds to recruit proteins to these specific compartments. 13 different isoforms have been identified in mammals, several of which have been implicated in disease, but the molecular mechanisms underlying pathogenesis are poorly understood. In this study, we elucidate a role of septin 9 (SEPT9) in the ubiquitin-dependent downregulation of the EGF receptor (EGFR), one of the best-studied members of receptor tyrosine kinases (RTK). This receptor responds to epidermal growth factor (EGF) and transduces signaling events to regulate cell survival and proliferation. Activated receptor is internalized and then either recycled back to the plasma membrane, or ubiquitylated to target the receptor for degradation. In this study, we show that depletion of SEPT9 in Hela cells decreases surface levels of epidermal growth factor receptors (EGFRs) to nearly 50% by enhancing receptor degradation. EGFR internalization is unaffected by SEPT9, independent of the mode of endocytosis. A PxxxPR consensus motif located within the N-terminal domain of SEPT9 (aa 125-130 of SEPT9_v3) supports its association with all three SH3 domains of the adaptor protein CIN85 (also known as SH3KBP1). A CIN85–SEPT9 complex is localized exclusively at the plasma membrane, where SEPT9 is recruited to EGF-engaged receptors in a CIN85-dependent manner. Furthermore, we show that CIN85 recruits septin complexes, most probably a SEPT2/6/7/9 complex, to sites of activated EGFR. Biochemical fractionation experiments reveal a ligand-induced recruitment of these septin complexes from the cytosol to membrane. We further characterize the CIN85-SEPT9 interaction by a structural approach and show that SEPT9 and Cbl, the E3 ubiquitin ligase responsible for EGFR ubiquitylation, share the same binding surface on the SH3 A domain of CIN85. We demonstrate that SEPT9 negatively regulates EGFR degradation by preventing the association of Cbl with CIN85, resulting in reduced EGFR ubiquitylation. Our proteomic analysis of the EGFR interactome at the plasma membrane restricts this effect to the isoform b-Cbl, whereas the second isoform c-Cbl is recruited in a SEPT9-independent manner. We also identify two migration- associated proteins, the class II PI3 kinase PI3KC2b and the Rho-GEF VAV3, to be slightly enriched at activated EGFR upon SEPT9 depletion. Taken together, these observations identify a novel role for septins in stabilizing the EGF receptor by protecting them from degradation. In addition, we apply a proteomic approach to identify potential novel interactors of SEPT9 including regulators of actin and tubulin polymerization, components of the COPII-coat and several E3 ubiquitin ligases. In line with the latter finding, we show an upregulation of the ubiquitin-binding protein p62 upon loss of SEPT9. In conclusion, SEPT9 might be implicated also in other ubiquitin-dependent processes such as autophagy.

Septine bezeichnen eine Familie von GTP-bindenen Proteinen, die an einer Vielzahl von biologischen Prozessen beteiligt sind wie beispielsweise Zellteilung, Zellmotilität und Membrantransport. Die Assoziierung mit Membranen ermöglicht ihnen die Bildung von Diffusionsbarrieren, die klar abgegrenzte zelluläre Domänen definieren. Durch Assemblierung in oligomere Filamente bilden Septine zudem Gerüste aus, die andere Proteine zu diesen Kompartimenten rekrutieren. In Säugetieren wurden bislang 13 verschiedene Isoformen identifiziert. Einige Isoformen sind in Krankheiten impliziert, allerdings sind die molekularen Mechanismen der Pathogenese weitgehend unverstanden. In dieser Studie implizieren wir septin 9 (SEPT9) in die Ubiquitin-abhängige Herabregulierung des EGF Rezeptors (EGFR), einer der am besten studierten Rezeptoren der Familie der Rezeptor Tyrosin Kinasen (RTK). Wir zeigen, dass die Depletion von SEPT9 in Hela Zellen die Oberflächenkonzentration von EGFR durch Beschleunigung des Rezeptorabbaus auf nahezu 50% reduziert. Dabei wird die Internalisierung des Rezeptors nicht von SEPT9 beeinflusst, unabhängig von dem Modus der Endozytose. Biochemische Experimente belegen, dass ein PxxxPR Konsensus Motif in der N-terminalen Region von SEPT9 (aa 125-130 von SEPT9_v3) verantwortlich ist für die Interaktion mit allen drei SH3-Domänen des Adapterproteins CIN85, auch bekannt unter dem Namen SH3KBP1. Ein Komplex bestehend aus CIN85 und SEPT9 ist ausschließlich an der Plasmamembran zu finden, wo SEPT9, in Abhängigkeit von CIN85, zu EGF-gebundenen Rezeptoren rekrutiert wird. Des Weiteren zeigen wir, dass CIN85 ganze Septin-Komplexe, wahrscheinlich SEPT2/6/7/9, zu aktiviertem EGFR rekrutiert. Biochemische Fraktionierungs-Experimente weisen darauf hin, dass die Ligandenstimulierung eine Rekrutierung dieser Septin-Filamente aus dem Zytosol an Membrandomänen zur Folge hat. Um die Funktion von SEPT9 während der Stabilisierung von EGFR mechanistisch zu verstehen, wurden stukturelle Analysen der CIN85/SEPT9 Interaktion durchgeführt. Diese Experimente belegen eindrücklich, dass SEPT9 an die gleiche Oberfläche in der SH3 A-Domäne von CIN85 bindet wie Cbl, eine Ubiquitin-Ligase, die für die EGFR-Ubiquitylierung verantwortlich ist. Wir demonstrieren ferner, dass SEPT9 den EGFR-Abbau negativ reguliert, indem es die Assozierung von Cbl mit CIN85 verhindert. Dies führt zu einer Hemmung der EGFR-Ubiquitylierung. Unsere proteomische Analyse des EGFR Interaktoms an der Plasmamembran begrenzt diesen Effekt auf die Isoform b-Cbl, während c-Cbl unabhängig von SEPT9 an den Rezeptor rekrutiert werden kann. Die Depletion von SEPT9 erlaubt daneben die Detektion erhöhter Mengen der PI3 Kinase PI3KC2b und dem Rho-GEF VAV3, die mit dem EGFR assoziieren. Zusammengefasst identifizieren unsere Beobachtungen eine neue Rolle für Septin GTPasen für den Schutz des EGFR vor lysosomalen Abbau, sowie für die Modulation der durch EGF initiierten Signalkaskaden. Zusätzlich identifizieren wir mittels einer proteomischen Methode potentielle neue Interaktionspartner von SEPT9 wie zum Beispiel Regulatoren der Aktin- und Tubulin-Polymerisation, Komponenten von COPII-Vesikeln und mehrere E3 Ubiquitin Ligasen. In Übereinstimmung mit Letztgenanntem können wir in Abwesenheit von SEPT9 eine Erhöhung des Ubiquitin-bindenden Proteins p62 detektieren. Diese Resultate weisen auf eine potentielle Funktion von SEPT9 auch in anderen Ubiquitin-abhängigen Prozessen hin, beispielsweise für den Prozess der Autophagie.