dc.contributor.author
Diesenberg, Katrin
dc.date.accessioned
2018-06-07T18:01:54Z
dc.date.available
2015-12-18T10:06:51.273Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4558
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8758
dc.description
I.Abstract 5 II.Zusammenfassung 7 1 Introduction 9 1.1 Receptor tyrosine
kinases (RTKs) 9 1.1.1 The EGFR signaling interactome 11 1.1.2 Internalization
13 1.1.3 Endosomal trafficking 15 1.1.3.1 The E3 ligase Cbl ubiquitylates EGFR
15 1.1.3.2 Ubiquitylated EGFR is sorted for lysosomal degradation 18 1.1.3.3
Unubiquitylated receptor is recycled to the plasma membrane 20 1.1.4
'Crosstalk' between EGF-induced pathways 20 1.1.5 The adaptor protein CIN85 21
1.2 Septin GTPases 24 1.2.1 Nomenclature and structure of septins 24 1.2.2
Biological functions of septin GTPases in mammals 27 1.2.3 Septins in human
pathologies 29 1.3 Septin 9 31 1.3.1 Biological role of SEPT9 in mammals 32
1.3.2 SEPT9 in disease 33 1.4 Breast Cancer 34 1.5 Aims of this study 36 2
Material and Methods 37 2.1 Materials 37 2.1.1 Chemicals and disposables 37
2.1.2 Solutions and media 38 2.1.3 DNA Oligonucleotides 40 2.1.4 Small
interfering RNA oligonucleotides 40 2.1.5 Synthetic peptides 41 2.1.6
Bacterial strains 41 2.1.7 Eukaryotic cell lines 41 2.1.8 Plasmids 41 2.1.9
Enzymes 43 2.1.10 Antibodies 43 2.1.11 Software and internet resources 45 2.2
Molecular biological methods 46 2.2.1 Primers for cloning 46 2.2.2 Polymerase
chain reaction and site-directed mutagenesis 46 2.2.3 Preparative and
analytical agarose gel electrophoresis 47 2.2.4 Purification of DNA from
agarose gels and PCRs 47 2.2.5 Restriction digests 47 2.2.6 Dephosphorylation
of vector DNA 48 2.2.7 Ligation of DNA fragments into linearized vectors 48
2.2.8 Preparation of chemically competent E. coli 48 2.2.9 Transformation of
chemically competent E. coli 48 2.2.10 Glycerol stocks 49 2.2.11 Over night
cultures of E. coli 49 2.2.12 Purification of plasmid DNA from E. coli
cultures 49 2.2.13 UV spectroscopy for determining nucleic acid concentrations
49 2.2.14 Sequencing 50 2.3 Biochemical methods 51 2.3.1 Protein determination
(Bradford assay) 51 2.3.2 SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 51
2.3.3 Immunoblotting 52 2.3.4 Densitometric Analysis of Western Blots 53 2.3.5
Preparation of protein extracts from eukaryotic cells 53 2.3.6
Immunoprecipitation 53 2.3.7 Expression of recombinant proteins in E. coli 53
2.3.8 Purification of GST- and His6 -fusion proteins expressed in E. coli 54
2.3.9 GST-Pulldown assay 55 2.3.10 In vitro binding assay 55 2.3.11
Purification of denatured protein from inclusion bodies 55 2.3.12 Affinity
purification of polyclonal antibodies from rabbit serum 56 2.3.13 Cytosol
membrane fractionation 58 2.3.14 EGFR degradation 58 2.3.15 NMR spectroscopy
59 2.3.16 125I-EGF uptake 60 2.3.17 125I-EGF recycling 60 2.3.18 EGFR
downstream signaling 61 2.3.19 EGFR ubiquitylation 61 2.3.20 Analysis of EGFR
interactome by SILAC-based mass spectrometry 62 2.4 Cell biological methods 64
2.4.1 Mammalian cell culture 64 2.4.2 Long-term storage of mammalian cells 64
2.4.3 Transfection of plasmid DNA 64 2.4.4 Small interfering RNA treatments
and rescue experiments 64 2.4.5 Immunofluorescence 65 2.4.6 EGF uptake 66
2.4.7 Surface binding of EGF 66 2.4.8 Fluorescence microscopy 66 2.4.9 Image
analysis and quantification 67 2.5 Statistics 67 3 Results 68 3.1 SEPT9
controls EGFR degradation 68 3.1.1 Depletion of SEPT9 in fibroblasts decreases
surface levels of EGFR 68 3.1.2 SEPT9 regulates sorting of EGFR between
lysosomal and recycling pathways 70 3.1.3 SEPT9 stabilizes heterooligomeric
septin filaments 73 3.2 SEPT9 forms a complex with the adaptor protein CIN85
74 3.2.1 The N-terminus of SEPT9 is important for stabilizing EGFRs 74 3.2.2
SEPT9 associates with all three SH3 domains of CIN85 75 3.2.3 CIN85 binds to a
PR-rich motif located in the N-terminus of SEPT9 77 3.3 CIN85 recruits SEPT9
to activated EGFR at the cell surface 80 3.3.1 SEPT9-containing complexes are
recruited to activated EGFR at the plasma membrane 80 3.3.2 SEPT9 localizes to
activated EGFR exclusively at the plasma membrane 85 3.3.3 EGF stimulation
induces SEPT9 association with membranes 87 3.3.4 SEPT9 impairs ERK signaling
88 3.4 SEPT9 regulates Cbl-dependent ubiquitylation of EGF receptors 89 3.4.1
SEPT9 and the E3 ligase Cbl occupy the same binding site on CIN85 89 3.4.2
SEPT9 competes with Cbl for binding to CIN85 91 3.4.3 SEPT9 regulates
Cbl-b-mediated downregulation of EGFR 92 3.5 Identification of novel SEPT9
interaction partners 95 3.5.1 Proteomic analysis of the SEPT9_v3 interactome
95 3.5.2 Implications of SEPT9 in membrane trafficking – preliminary data 97 4
Discussion 98 4.1 CIN85 recruits SEPT9-containing complexes to sites of
activated EGFR at the plasma membrane 98 4.2 SEPT9 regulates Cbl-b-dependent
ubiquitylation of EGF receptors 99 4.3 Septin complexes form diffusion
barriers 103 4.4 Putative isoform-specific effects of SEPT9 104 4.5 A putative
role of septin complexes in EGFR trafficking 107 4.6 Conclusions and Outlook
108 4.6.1 Trafficking of other RTKs 108 4.6.2 Biological role of SEPT9 in
cancer 110 4.6.3 Putative complex formation of CIN85/CD2AP with other septin
isoforms 113 5 Bibliography 115 6 Appendix 139
dc.description.abstract
Septins constitute a family of GTP-binding proteins that are involved in a
broad range of cellular processes including membrane trafficking, cell
division and motility. By associating with membranes they form diffusion
barriers to create distinct cellular domains, which serve as scaffolds to
recruit proteins to these specific compartments. 13 different isoforms have
been identified in mammals, several of which have been implicated in disease,
but the molecular mechanisms underlying pathogenesis are poorly understood. In
this study, we elucidate a role of septin 9 (SEPT9) in the ubiquitin-dependent
downregulation of the EGF receptor (EGFR), one of the best-studied members of
receptor tyrosine kinases (RTK). This receptor responds to epidermal growth
factor (EGF) and transduces signaling events to regulate cell survival and
proliferation. Activated receptor is internalized and then either recycled
back to the plasma membrane, or ubiquitylated to target the receptor for
degradation. In this study, we show that depletion of SEPT9 in Hela cells
decreases surface levels of epidermal growth factor receptors (EGFRs) to
nearly 50% by enhancing receptor degradation. EGFR internalization is
unaffected by SEPT9, independent of the mode of endocytosis. A PxxxPR
consensus motif located within the N-terminal domain of SEPT9 (aa 125-130 of
SEPT9_v3) supports its association with all three SH3 domains of the adaptor
protein CIN85 (also known as SH3KBP1). A CIN85–SEPT9 complex is localized
exclusively at the plasma membrane, where SEPT9 is recruited to EGF-engaged
receptors in a CIN85-dependent manner. Furthermore, we show that CIN85
recruits septin complexes, most probably a SEPT2/6/7/9 complex, to sites of
activated EGFR. Biochemical fractionation experiments reveal a ligand-induced
recruitment of these septin complexes from the cytosol to membrane. We further
characterize the CIN85-SEPT9 interaction by a structural approach and show
that SEPT9 and Cbl, the E3 ubiquitin ligase responsible for EGFR
ubiquitylation, share the same binding surface on the SH3 A domain of CIN85.
We demonstrate that SEPT9 negatively regulates EGFR degradation by preventing
the association of Cbl with CIN85, resulting in reduced EGFR ubiquitylation.
Our proteomic analysis of the EGFR interactome at the plasma membrane
restricts this effect to the isoform b-Cbl, whereas the second isoform c-Cbl
is recruited in a SEPT9-independent manner. We also identify two migration-
associated proteins, the class II PI3 kinase PI3KC2b and the Rho-GEF VAV3, to
be slightly enriched at activated EGFR upon SEPT9 depletion. Taken together,
these observations identify a novel role for septins in stabilizing the EGF
receptor by protecting them from degradation. In addition, we apply a
proteomic approach to identify potential novel interactors of SEPT9 including
regulators of actin and tubulin polymerization, components of the COPII-coat
and several E3 ubiquitin ligases. In line with the latter finding, we show an
upregulation of the ubiquitin-binding protein p62 upon loss of SEPT9. In
conclusion, SEPT9 might be implicated also in other ubiquitin-dependent
processes such as autophagy.
de
dc.description.abstract
Septine bezeichnen eine Familie von GTP-bindenen Proteinen, die an einer
Vielzahl von biologischen Prozessen beteiligt sind wie beispielsweise
Zellteilung, Zellmotilität und Membrantransport. Die Assoziierung mit
Membranen ermöglicht ihnen die Bildung von Diffusionsbarrieren, die klar
abgegrenzte zelluläre Domänen definieren. Durch Assemblierung in oligomere
Filamente bilden Septine zudem Gerüste aus, die andere Proteine zu diesen
Kompartimenten rekrutieren. In Säugetieren wurden bislang 13 verschiedene
Isoformen identifiziert. Einige Isoformen sind in Krankheiten impliziert,
allerdings sind die molekularen Mechanismen der Pathogenese weitgehend
unverstanden. In dieser Studie implizieren wir septin 9 (SEPT9) in die
Ubiquitin-abhängige Herabregulierung des EGF Rezeptors (EGFR), einer der am
besten studierten Rezeptoren der Familie der Rezeptor Tyrosin Kinasen (RTK).
Wir zeigen, dass die Depletion von SEPT9 in Hela Zellen die
Oberflächenkonzentration von EGFR durch Beschleunigung des Rezeptorabbaus auf
nahezu 50% reduziert. Dabei wird die Internalisierung des Rezeptors nicht von
SEPT9 beeinflusst, unabhängig von dem Modus der Endozytose. Biochemische
Experimente belegen, dass ein PxxxPR Konsensus Motif in der N-terminalen
Region von SEPT9 (aa 125-130 von SEPT9_v3) verantwortlich ist für die
Interaktion mit allen drei SH3-Domänen des Adapterproteins CIN85, auch bekannt
unter dem Namen SH3KBP1. Ein Komplex bestehend aus CIN85 und SEPT9 ist
ausschließlich an der Plasmamembran zu finden, wo SEPT9, in Abhängigkeit von
CIN85, zu EGF-gebundenen Rezeptoren rekrutiert wird. Des Weiteren zeigen wir,
dass CIN85 ganze Septin-Komplexe, wahrscheinlich SEPT2/6/7/9, zu aktiviertem
EGFR rekrutiert. Biochemische Fraktionierungs-Experimente weisen darauf hin,
dass die Ligandenstimulierung eine Rekrutierung dieser Septin-Filamente aus
dem Zytosol an Membrandomänen zur Folge hat. Um die Funktion von SEPT9 während
der Stabilisierung von EGFR mechanistisch zu verstehen, wurden stukturelle
Analysen der CIN85/SEPT9 Interaktion durchgeführt. Diese Experimente belegen
eindrücklich, dass SEPT9 an die gleiche Oberfläche in der SH3 A-Domäne von
CIN85 bindet wie Cbl, eine Ubiquitin-Ligase, die für die EGFR-Ubiquitylierung
verantwortlich ist. Wir demonstrieren ferner, dass SEPT9 den EGFR-Abbau
negativ reguliert, indem es die Assozierung von Cbl mit CIN85 verhindert. Dies
führt zu einer Hemmung der EGFR-Ubiquitylierung. Unsere proteomische Analyse
des EGFR Interaktoms an der Plasmamembran begrenzt diesen Effekt auf die
Isoform b-Cbl, während c-Cbl unabhängig von SEPT9 an den Rezeptor rekrutiert
werden kann. Die Depletion von SEPT9 erlaubt daneben die Detektion erhöhter
Mengen der PI3 Kinase PI3KC2b und dem Rho-GEF VAV3, die mit dem EGFR
assoziieren. Zusammengefasst identifizieren unsere Beobachtungen eine neue
Rolle für Septin GTPasen für den Schutz des EGFR vor lysosomalen Abbau, sowie
für die Modulation der durch EGF initiierten Signalkaskaden. Zusätzlich
identifizieren wir mittels einer proteomischen Methode potentielle neue
Interaktionspartner von SEPT9 wie zum Beispiel Regulatoren der Aktin- und
Tubulin-Polymerisation, Komponenten von COPII-Vesikeln und mehrere E3
Ubiquitin Ligasen. In Übereinstimmung mit Letztgenanntem können wir in
Abwesenheit von SEPT9 eine Erhöhung des Ubiquitin-bindenden Proteins p62
detektieren. Diese Resultate weisen auf eine potentielle Funktion von SEPT9
auch in anderen Ubiquitin-abhängigen Prozessen hin, beispielsweise für den
Prozess der Autophagie.
de
dc.format.extent
138 Seiten
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
ubiquitylation
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Septin 9 (SEPT9) negatively regulates ubiquitin-dependent downregulation of
epidermal growth factor receptor (EGFR)
dc.contributor.contact
katrin@diesenberg.de
dc.contributor.inspector
Prof. Dr. Oliver Daumke
dc.contributor.inspector
Prof. Dr. Stephan Sigrist
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Michael Krauß
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Volker Haucke
dc.date.accepted
2015-12-08
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000100926-3
dc.title.translated
Septin 9 (SEPT9) inhibiert die ubiquitin-abhängige Herabregulierung des
epidermal growth factor receptor (EGFR)
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000100926
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000018328
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open access