Polyomavirus-abgeleitete Virus-ähnliche Partikel als potentielle Impfstoffe

Abstract

Hintergrund: Krebs-spezifische Immuntherapien stellen eine vielverspechende Möglichkeit zur Ergänzung der etablierten chirurgischen, pharmakologischen und radiologischen Krebstherapien dar. Eine spezielle Immuntherapie basiert auf der Induktion von Immunantworten gegen tumorassoziierte Autoantigene, die auf Tumorzellen überexprimiert werden wie z.B. carcinoembryonales Antigen (CEA) und Mucin 1 (MUC1). Aufgrund ihrer immunologischen Eigenschaften stellen Virus-ähnliche Partikel (VLP) interessante Träger zur Entwicklung neuer Impfstoffe dar. Zielstellung: Das Ziel der Untersuchungen bestand in der Herstellung und Charakterisierung von autologen Polyomavirus-VLP und chimären Hamsterpolyomavirus (HaPyV)-abgeleiteten VLP. Methoden: Unmodifizierte Hauptkapsidproteine VP1 von Nager- und Primatenpolyomaviren sowie VP1-Fusionsproteine von HaPyV wurden in der Hefe Saccharomyces cerevisiae hergestellt. Die VLP-Reinigung erfolgte durch Ultrazentrifugation im Cäsiumchlorid-Dichtegradienten. Zum Studium der Aufnahmewege in humane dendritische Zellen (hDC) wurden die VLP mit CFDA markiert und die Aufnahme bei Verwendung von spezifischen Hemmstoffen durch FACS-Analyse charakterisiert. Die Ausreifung von humanen dendritischen Zellen nach Applikation von VLP unterschiedlicher Polyomaviren wurde durch FACS-Analyse von Oberflächenmarkern und durch funktionelle Analysen bestimmt. Die humorale Immunität von chimären VLP mit CEA-Insertionen wurde durch Immunisierung von Balb/c-Mäusen und nachfolgende Enzymimmunoassay(EIA)-Untersuchungen der Mausseren charakterisiert. Die T-Zell-Immunität von VLP mit MUC1-Inserts wurde in vitro durch Messung der Frequenz von MUC1-spezifischen CD8+ T-Zellen im Tetramer- und Interferon-gamma-assay geprüft. Ergebnisse: Mit Hilfe des Hefeexpressionssystems konnten die chimären HaPyV-VP1-abgeleiteten VLP mit einem oder zwei CEA- oder MUC1-Insertionen in hoher Ausbeute produziert werden. Durch Herstellung von VLP mit der 238 Aminosäuren langen Sequenz des grünfluoreszierenden Proteins konnte die hohe Insertionskapazität des HaPyV- VP1 bestätigt werden. Die VLP der verschiedenen Polyomaviren wurden alle durch hDC mittels Makropinozytose aufgenommen, während sich die Rezeptor- vermittelten Aufnahmewege unterschieden. Die Nager-Polyomavirus-abgeleiteten VLP induzierten eine Reifung von hDC und vermittelten in einem in vitro-Modell eine CD8+ T-Zell-Immunität. Adjuvantfreie Immunisierungen von Balb/c-Mäusen mit chimären CEA-tragenden VLP zeigten eine Abhängigkeit der Antikörperantwort vom Insertionsort im VP1. Für ausgewählte VLP konnte in der Maus eine langanhaltende Immunität für das CEA-Fremdinsert gezeigt werden. Monoklonale Antikörper gegen MUC1-Fremdinsertion von VLP erkannten das native Mucin 1 auf Tumorzellen. Schlußfolgerung: HaPyV-abgeleitete chimäre VLP stellen einen interessanten Ansatzpunkt für zukünftige Impfstoffe zur Tumortherapie beim Menschen dar.

Introduction: Cancer-specific Immunotherapies play a promising role as supplements to well-established cancer therapies such as oncological, pharmacological and radiological treatment. A group of special immunotherapies is based on inducing immuno stimulation against tumor-associated auto-antigens like carcinoembrional antigen (CEA) and mucin 1 (MUC1). Due to their immunological characteristics, virus-like particles (VLP) represent promising carrier candidates for novel vaccines. Aim: The aim of this work was to build, produce and characterize VLPs derived of autologous and chimaeric polyomaviruses. Methods: Unmodified main-capsid protein VP1 of rodent- and primate-polyomaviruses and fusion-proteins of hamsterpolyomavirus (HaPyV) were expressed in Saccharomyces cerevisiae. Purification of VLPs took place via ultracentrifugation in caesiumchlorine gradients. To study uptake characteristics into human dendritic cells (hDC), VLPs were labeled with CFDA and incubated with varying uptake inhibitors. Maturation of human dendritic cells was measured by FACS via surface maturation markers after application of autologous and chimaeric VLPs and in functional assays. The humoral immunogenicity of chimaeric VLPs with CEA-inserts was tested by immunizing Balb/c-mice and measuring serum antibody-titers in enzyme-linked immuno- assays (EIA). The CD8+ T-cell immunogenicity of chimaeric VLPs with MUC1-inserts was measured via FACS analysis of MUC1-specific CD8+ T-cells frequency and Interferon-gamma-assays. Results: Chimaeric Hamsterpolyoma-VLPs (HaPyV-VLP) with one or two MUC1- or CEA-inserts were produced with high yield in the yeast expression system. The high insertion capacity of HaPyV-VP1 was affirmed by the successful expression of VLPs with an insert of the 238 aa long green fluorescent protein. Uptake of all VLPs of different polyomaviruses took place via macropinocytosis, whereas receptor-mediated uptake pathways differed. VLPs derived of rodent origin induced maturation in human dendritic cells and CD8+ T-cell immunity. Adjuvant-free Immunization of Balb/c mice showed that long-lasting antibody-titers against the CEA-insert depends on its insertion site. Monoclonal antibodies against MUC1-inserts were able to detect native mucin in various tumorcell lines. Conclusion: Chimaeric HaPyV-derived virus-like particles represent interesting candidates for future tumor vaccines in humanes.