Improvement and development of methods to propagate Theileria annulata in vitro and to study the T. annulata life cycle based on cell culture techniques and an artificial tick feeding System

Abstract

Tropical bovine theileriosis (TT, Theileria annulata infection) is a protozoan disease that affects cattle in the Mediterranean, Middle East and Asia. In countries where it occurs, the disease is mainly transmitted by ticks of the genus Hyalomma. Despite the availability of various control strategies, TT is still a major problem for the livestock industry in several countries. Progress in developing and improving control options (mainly vaccination) against T. annulata and its vectors is limited by several factors, including limited knowledge of the attenuation mechanism of the cell lines used as live vaccines, the need for experimental animals to maintain tick colonies, to produce infected tick challenge material and to assess the attenuation status. Another point of ethical concern is the use of Foetal Bovine Serum (FBS) in the production of the T. annulata cell culture vaccine. This reliance on the use of animal models and products, which is associated with high costs and logistical, biosafety and ethical constraints, frames the research approaches described in this thesis.

In the four main chapters, different aspects in studying the life cycle of T. annulata in vitro while adhering to the 3Rs principle are described. This includes (i) establishing a cell line using serum-free culture medium, replacing the use of FBS, (ii) comparing virulent and attenuated passages of T. annulata using RNA-seq to improve our understanding of virulence factors and the attenuation process and catalogue potential attenuation markers, (iii) inducing merogony in T. annulata cell lines and obtain piroplasm-containing erythrocytes that could later be used to infect ticks in vitro, and (iv) exploit recent advances in artificial tick feeding methods to artificially feed all life stages of two-host ticks Hyalomma scupense and H. excavatum and the three-host tick Hyalomma dromedarii. The successful feeding of all stages of Hyalomma ticks in vitro combined with the generation of T. annulata infected erythrocytes in vitro, may lead to the closure of the T. annulata life cycle in vitro without the use of experimental animals.

The results of these studies are encouraging, although they do require optimization, and are expected to contribute to the production of culture-derived Theileria vaccines, improve our understanding of the attenuation process and provide valuable tools to study the Theileria life cycle, including its interaction with vector ticks in vitro. It will also contribute to the 3Rs principle for humane animal research by providing a viable alternative to the use of laboratory animals in Theileria research. These findings could also be extrapolated to other pathogens with similar life cycles.

Die tropische Rindertheileriose (TT, Theileria annulata-Infektion) ist eine Protozoenerkrankung, die Rinder im mediterranen Raum, im Mittleren Osten und in Asien vorkommt. In den betroffenen Ländern wird die Krankheit hauptsächlich durch Zecken der Genus Hyalomma übertragen. Obwohl verschiedene Bekämpfungsstrategien verfügbar sind, ist die TT noch immer ein bedeutendes ökonomisches Problem für die Tierproduktion. Die Fortschritte bei der Entwicklung und Verbesserung von Kontrollmöglichkeiten (hauptsächlich von Impfungen) gegen T. annulata und ihrer Vektoren werden durch mehrere Faktoren eingeschränkt, wie der begrenzten Kenntnis des Attenuierungsmechanismus der für die Lebendimpfstoffe verwendeten Zelllinien, der erforderlichen Nutzung von Versuchstieren für die Aufrechterhaltung von Zeckenkolonien, der Produktion infizierter Zecken für Infektionsversuche und der Bewertung des Attenuierungssstatus. Die ethisch bedenkliche Verwendung von fötalem Rinderserum (FBS) bei der Herstellung des T. annulata-Zellkulturimpfstoffs, die Abhängigkeit von Tiermodellen und -produkten verbunden mit hohen Kosten, logistischen und biosicherheits-relevanten Problemen beinhaltet den thematischen Forschungsansatz der vorliegenden Thesis.

In den vier Hauptkapiteln werden verschiedene Aspekte der Untersuchung des Lebenszyklus von T. annulata in vitro unter Einhaltung des 3R-Prinzips einer humanen Tierforschung beschrieben. Dazu gehören (i) die Etablierung einer Zelllinie unter Ersetzung von FBS durch ein serumfreies Kulturmedium, (ii) der Vergleich virulenter und abgeschwächter Passagen von T. annulata genutzer RNA-seq, um das Verständnis von Virulenzfaktoren und des Attenuierungsprozesses zu verbessern und um potenzielle Attenuierungsmarker zu katalogisieren, (iii) die Induktion von Merogonie in T. annulata-Zelllinien zu stimulieren und piroplasmahaltige Erythrozyten zu gewinnen zur späteren Nutzung für eine in vitro-Infektion von Zecken und (iv) die Nutzung jüngster methodischer Fortschritte bei der künstlichen Zeckenfütterung, um alle Lebensstadien der zweiwirtigen Zecken Hyalomma scupense und H. excavatum sowie der dreiwirtigen Zecke H. dromedarii künstlich zu füttern. Die erfolgreiche Fütterung aller Stadien von Hyalomma-Zecken in vitro sowie der Herstellung von mit T. annulata infizierten Erythrozyten in vitro kann dazu führen, dass der Lebenszyklus von T. annulata in vitro ohne den Einsatz von Versuchstieren geschlossen werden kann.

Die Ergebnisse dieser Studien sind ermutigend, auch wenn sie noch optimiert werden müssen. Sie sind ein Beitrag zur angestrebten Herstellung von Theileria-Vaccinen aus Kulturen, verbessern das Verständnis des Attenuierungsprozesses und unterstützen Untersuchungen zum Lebenszyklus von Theileria spp. einschließlich ihrer in vitro Interaktion mit Vektorzecken. Die Ergebnisse tragen zum 3R Prinzip humaner Tierforschung bei, indem sie eine praktikable Alternative zur Verwendung von Labortieren in der Theileria-Forschung bieten. Diese Erkenntnisse könnten auch auf andere Krankheitserreger mit gleichen Lebenszyklen extrapoliert werden.