In vivo evidence for a new concept of bacterial translation initiation

Abstract

The canonical initiation mode starts with the small ribosomal subunit, which with help of initiation factors and the initiator tRNA finds the start signal for protein synthesis on an mRNA. However, there are many observations in the literature that cannot easily be reconciled with this initiation mode. We found that a resolution of these difficulties can be provided with an alternative initiation mode, the so-called 70S-scanning mode. In this thesis we provide in vivo evidences supporting it. Towards this end we identify features that critically participate in this process. 1\. According to general wisdom the initiation factor IF1 binds to 30S subunits helping IF2 and IF3 to select the ribosomal binding site on the mRNA. The factor is believed to leave the 30S subunit upon association with the large ribosomal subunit. Therefore, it should never be present on 70S ribosomes. We determined the ribosome location of IF1 using cytosol-profiles on sucrose gradients and identified IF1 via Western blotting. It was strikingly found that IF1 is present specifically on 70S and polysomes rather than on 30S subunits. IF3 is thought to be an anti-association factor and thus should not be able to bind to 70S ribosomes. We found it on 30S subunits as expected, but 1/3 of the amount was present on 70S and significant amounts even on disomes. Obviously, the functional horizon of these initiation factors is wider than thought before. 2\. IF1 is an essential factor. To study its function in vivo we constructed a strain, where the chromosomal IF1 was knocked out and the IF1 gene present on a plasmid after an inducible AraB promoter (in the presence of arabinose IF1 is expressed, in the presence of glucose it is not). The effects of insufficient IF1 amounts can be summarized as follows: (i) A slowed growth rate with doubled generation time. (ii) Serious defects in 50S assembly leading to accumulation of 50S-precursors, accumulation of 30S subunit and strikingly poor polysome pattern. Obviously, the block in 50S formation reduces the formation of 70S and thus explains the indispensability of IF1 for bacterial cell survival. The specific defects of the 50S assembly are consistent with an assumption of involvement of IF1 in scanning ribosomes leading to stoichiometric synthesis of ribosomal proteins. 3\. Our assumption was that IF1 is essential for the 70S scanning initiation. To test this we constructed a bicistronic mRNA expressing Renilla and Firefly luciferase, respectively. The hypothesis predicts that the first cistron might be preferentially initiated in the canonical mode, whereas for the second expression the IF1-dependent scanning mechanism would be more important. Precisely this was observed: The expression of the second cistron was 4.5 times reduced, when the cells were starved for IF1. Remarkably, the expression of the first cistron was practically not affected at all by reducing IF1 amounts. Western blotting showed that this expression-reduction was accompanied by reducing the IF1 amounts for about 50%. This observation distinctly presents the evidence of involvement of IF1 in sliding 70S ribosomes, leading to translation initiation of second cistron. 4\. Eventually we demonstrated that the 70S-scanning type of initiation also exists for the expression of monocistronic mRNAs. With a strong secondary structure in the 5’-UTR abolishing the scanning mode we observed that the expression of the reference protein GFP was not affected by various levels of IF1, whereas without secondary structure allowing both initiation modes the expression was strongly IF1 dependent. In summary we provided strong evidence that IF1 is a 70S specific factor and participates crucially in the 70S-scanning type of initiation. Since the 70S-scanning mode is importantly involved in the expression of both mono- and polycistronic mRNAs it might be even the prevailing initiation mode in the bacterial cell.

Das Standardmodell der Initiation beginnt mit der kleinen Untereinheit, die mit Hilfe der Initiationsfaktoren und der Initiator fMet-tRNA das Startsignal für die Proteinsynthese auf einer mRNA findet. Jedoch sind einige Beobachtungen nicht einfach mit dem Standardmodell in Einklang zu bringen. Wir prüfen in der vorliegenden Arbeit eine Hypothese, nach der neben dem Standardmodell eine zweite Initiationsart existiert, das sogenannte 70S- Scanning Modell, das die Ungereimtheiten befriedengend erklären kann. Die erzielten Ergebnisse der in vivo Untersuchungen unterstützen das Modell: 1\. Nach allgemeiner Ansicht bindet der Initiationsfaktor IF1 an die kleine Untereinheit und unterstützt die Faktoren IF2 und IF3, die ribosomale Bindungsstelle für den Start der Proteinsynthese auf einer mRNA zu finden. Die Annahme ist, dass IF1 die 30S Untereinheit nach Assoziation der großen verläßt. Daraus folgt, daß dieser Faktor nicht auf 70S Ribosomen anzutreffen sein soll. Wir bestimmten die IF1 Lokalisation auf ribosomalen Partikeln mittels Cytosol-Profilen auf Sucrose-Gradienten und anschließender IF1 Identifikation mittels Western-Blot. Zu unserer Überraschung fanden wir IF1 ausschließlich auf 70S und zu einem geringen Anteil auf Disomen, aber nicht auf der kleinen Untereinheit. IF3 als Antiassoziationsfaktor wird für einen spezifischen 30S Faktor gehalten, der nicht auf 70S Ribosomen anzutreffen sein soll. Unsere Western-Analyse zeigte, dass wie erwartet ein großer Teil des IF3 wie erwartet an die 30S Untereinheit bindet, aber etwa ein Drittel der Menge an 70S Ribosomen bindet. Es folgt daraus, dass der funktionelle Horizont beider Faktoren offenbar weiter reicht als allgemein angenommen. 2\. IF1 ist ein essentieller Faktor. Um dessen Funktionen in vivo zu testen, haben wir einen E. coli Stamm konstruiert, dem das chromosomale IF1-Gen fehlt und der Zelle auf einem Plasmid angeboten wird, dessen AraB Promoter die IF1 Synthese an- und ausschalten kann (in Gegenwart von Arabinose wird IF1 synthetisiert, während Glucose die Synthese abschaltet). Die Effekte einer IF1 Verarmung können folgendermaßen zusammengefaßt werden: (i) Eine 50% Reduktion der IF1 Menge halbiert die Wachstumsrate. (ii) Die Bildung der großen 50S Untereinheit ist schwer geschädigt, 50S Vorstufen werden angehäuft, 30S Untereinheiten akkumulieren mit dem Ergebnis, dass 70S Ribosomen sowie Polysomen deutlich vermindert sind. Die spezifischen Defekte des 50S Aufbaus können damit erklärt werden, daß IF1 an einem 70S-Scanning Initiations-modus beteiligt ist, was zu einer stöchiometrischen Synthese der ribosomalen Proteine führt. 3\. Unsere Annahme, dass IF1 wichtig für eine 70S-Scanning Initiation ist, wurde folgendermaßen getestet: wir konstruierten eine bi-cistronische mRNA, mit der die Renilla und die Feuerfliegen Luziferase exprimiert werden kann. Die produzierte Menge beider Luziferasen können in einem Ansatz ohne Überlappung getestet werden. Unsere Hypothese sagt voraus, dass das erste Cistron vornehmlich nach dem kanonischen 30S Modell initiiert wird, während bei der Expression des zweiten Cistrons der IF1 abhängige Scanning-Modus deutlicher beteiligt ist. Genau das wurde beobachtet: Eine IF1 Reduktion um 50% reduzierte die Translation des zweiten Cistrons um das 4,5 fache, während interessanterweise die Translationsleistung am ersten Cistron durch reduzierten IF1 Gehalt gar nicht beeinträchtigt wurde. Dieser Befund ist eine deutliche Unterstützung des Scanningmodells und belegt zum ersten Mal, dass IF1 wahrscheinlich ein spezifischer 70S Initiationsfaktor ist und eine geringe Rolle – wenn überhaupt – bei der kanonischen 30S Initiation spielt. 4\. Schließlich haben wir gezeigt, dass der 70S-Scanning Typ auch bei der Translation von mono-cistronischen mRNAs beteiligt ist. Bei einer mRNA mit einer starken Sekundärstruktur an der 5’-UTR, die 70S-Scanning verhindert aber eine 30S abhängige Initiation erlaubt, ist die Expression von GFP unabhängig von der IF1 Menge in der Zelle, während ohne Sekundärstruktur die GFP Synthese stark von der IF1 Menge abhängig war. Zusammengefasst, haben wir sehr starke Hinweise, dass IF1 ein spezifischer 70S-Scanning Initiationsfaktor ist, der eine bedeutende Rolle bei diesem neuen Typ der bakteriellen Initiation spielt. Da die 70S-Scanning Initiation sowohl bei der Initiation von poly- als auch mono-cistronischen mRNAs eine Rolle spielt, könnte dieser Initiationstyp sogar der in der bakteriellen Zelle vorherrschende sein.