Entwicklung einer therapeutischen Strategie bei Allergie und Asthma unter Einsatz von Ribozymen und DNAzymen

Abstract

Die komplexe Pathogenese allergischer Erkrankungen und des Asthma bronchiale macht die Entwicklung neuer Therapieansätze notwendig. Von grundlegender pathophysiologischer Bedeutung für die Entstehung allergischer Erkrankungen sind die Zytokine IL-4 und IL-13. In der IL-4- und IL-13-vermittelten Signaltransduktion nimmt der Transkriptionsfaktor STAT6 eine zentrale Stellung ein. Untersuchungen an stat6-knockout-Mäusen zeigen, daß stat6 für die Ausprägung des allergischen Phänotypes wesentlich ist. Mit der Anwendung von Ribozymen und DNAzymen wird eine therapeutische Strategie auf Nukleinsäure- Basis zur spezifischen Spaltung der mRNA des Transkriptionsfaktors stat6 der Maus verfolgt. Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten mstat6-spezifischen Ribozyme besitzen eine GUC-Konsensussequenz und 6 nt lange Bindungsarme. Potentielle Ribozym-Spaltstellen werden auf der Grundlage von Sekundärstrukturberechnungen der mstat6-RNA identifiziert und liegen in einzelsträngigen Loop-Strukturen. Für eine stabile Expression werden die für die Ribozyme kodierenden Oligonuleotide in die Expressionskassette pGvaL kloniert. Insgesamt finden drei mstat6-spezifische Ribozyme Verwendung, deren Aktivität unter zellfreien Bedingungen getestet wird. Alle drei untersuchten Ribozyme sind in-vitro nicht aktiv. Unter Verwendung eines Multiplex- Aktivitäts-Assays wird auf der RNA des stat6 der Maus ein Screening nach zugänglichen DNAzym-Spaltstellen vorgenommen. Die dafür eingesetzten DNAzyme haben eine RU-Konsensussequenz (R = A, G) und besitzen Bindungsarme mit einer Länge von jeweils 9 nt. Für die Lokalisation der Bindungsstellen ist die thermodynamische Stabilität ∆G0 der DNAzym-Substrat-Heteroduplex entscheidend. Die reziproke Korrelation von DNAzym-Aktivität und ∆G0 führt zur Auswahl von 41 DNAzym-Spaltstellen mit einem ∆G0 von jeweils ≤ \- 25 kcal/mol im Sequenzbereich von 150 - 600 bp sowie von 1,7 - 2 kb. Für die Auswahl des Sequenzbereiches 1,7 - 2 kb ist die Beschreibung von humanen stat6-Spleißvarianten von Bedeutung, da diese auf einer Deletion im Sequenzbereich von 1765 - 1863 bp beruhen. Von den 41 im Multiplex-Aktivitäts- Assay getesteten DNAzymen weisen acht DNAzyme eine Spaltungsaktivität auf. Die Testung aller acht DNAzyme in einem zellfreien System ergibt, daß sie über einen Zeitraum von 60 min aktiv sind. In weiterführenden Experimenten wird zu prüfen sein, ob die unter zellfreien Bedingungen aktiven DNAzyme auch in Zellkulturen sowie allergischen Mausmodellen wirksam sind.

The highly complex pathogenesis of allergic diseases such as asthma requires the development of new and specific therapeutical approaches. Both Interleukine-4 and Interleukine-13, respectively, are attributed to play an essential role in the development of allergic asthma via activation of the signal transducer and activator of transcription 6 (STAT6). Investigation of stat6-deficient allergic mice demonstrated that stat6 is critical involved in the allergic phenotype. By the application of ribozymes and DNAzymes a nucleic acid based therapeutical strategy was choosen to investigate whether murine stat6 mRNA could be specifically cleaved in-vitro. Murine stat6-specific ribozymes adopted a GUC consensus sequence with binding arms of both 6 nt and were developed on the basis of computational secondary structure calculation of the murine stat6 transcript. For stable ribozyme expression a recently described pGvaL expression cassette was used. However; all tested ribozymes did not show any in-vitro activity. With the use of a multiplex activity assay the murine stat6 transcript was screened for DNAzyme cleavage sites. The converse correlation between the thermodynamic stability of the DNAzyme- substrate heteroduplex and an improved DNAzyme activity revealed potential cleavage sites on the murine stat6 transcript. Within 41 DNAzymes tested in the multiplex assay eight DNAzymes showed distinct cleavage activities on the transcript. Subsequently, the results were strongly confirmed in a cell-free system. The used DNAzymes had RU consensus sequences with R = A, G and binding arms of 9 nt. Additional in-vitro analyses provide evidence that these stat6-specific DNAzymes were active over a time period of 60 minutes. Further experiments have to test the murine stat6-specific DNAzymes in cell based systems and appropriate allergic mice models.