Tight junctions (TJs) seal the paracellular space between epithelial and endothelial cells, and are essential for tissue compartmentalization and barrier formation. The backbone of the TJ is formed by a group of transmembrane proteins, called claudins. Claudins polymerize into strands and meshes through cis- and trans-interactions, and are expressed in different combinations, based on the needs of the respective tissue. The large protein family can be divided into pore- and barrier-formers claudins, with the former being selectively permeable to ions or water. Structural insight in claudin polymerization is limited; models have been created, but only of a few homopolymers. Recent studies have found only half of the claudin family to form homopolymers, whereas co-expression can promote polymerization of certain claudins. This thesis thus focuses on regulation of claudin polymerization. In the first part of the thesis, intrinsic regulation was examined by a comparison of claudin-3 and claudin-4. These proteins have high sequence homology, yet only claudin-3 polymerizes by itself in fibroblasts. With sequence alignment and molecular dynamics simulations, we predicted a motif in the second extracellular segment key to stable trans-interaction and polymerization. We mutated the two residues in claudin-4 into their claudin-3 equivalents and found that they promote polymerization in fibroblasts. Moreover, the mutated claudin-4 could (partially) rescue TJ localization, as well as the formation of a TJ barrier with ruffled morphology in TJ-deficient epithelial cells. Extrinsic regulation of claudin polymerization, specifically how co-expression of claudins can influence polymerization, was investigated next. Our focus was on claudin-16 and claudin-19, that form a cation-permeable copolymer in the thick ascending limb (TAL) of the kidney. Mutations in either protein cause familial hypomagnesemia with hypercalciuria and nephrocalcinosis, emphasizing their essential role in kidney Ca2+ transport. We also investigated claudin-14, that can block this cation-pore upon its hypercalcemia-induced expression, and is associated with kidney stone formation. It is known that non-polymerizing claudin-16 integrates into the claudin-19 meshwork, but how this is affected by claudin-14 is still poorly understood. Super-resolution microscopy in fibroblasts revealed that claudin-14 can replace claudin-16 in a strand-specific manner. We further validated this in epithelial cells with endogenous claudin-16 and in the TAL of hypercalcemic mice. Claudin-14 expression by transduction in epithelial cells, and in response to hypercalcemia in the mice, again led to claudin-16 replacement. Overall, we have identified a motif that intrinsically regulates claudin polymerization and have shown that claudin-14 replaces claudin-16 to regulate Ca2+ transport in the kidney. These insights form a basis to understand and manipulate claudin polymerization, for instance to improve drug delivery or to prevent pathogen entry. More directly, the knowledge of the claudin-14 regulatory mechanism can be used to develop treatments for kidney stones and other pathologies involving hypercalciuria.
Tight Junctions (TJs) versiegeln den parazellulären Raum zwischen Epithel- und Endothelzellen und sind für die Kompartimentierung des Gewebes und die Bildung von Barrieren unerlässlich. Das Rückgrat der TJ wird von einer Gruppe von Transmembranproteinen, den Claudinen, gebildet. Claudine polymerisieren durch cis- und trans-Interaktionen zu Strängen und Maschen und werden je nach den Bedürfnissen des jeweiligen Gewebes in unterschiedlichen Kombinationen exprimiert. Die große Proteinfamilie kann in poren- und barriere-bildende Claudine unterteilt werden, wobei Erstere selektiv für Ionen oder Wasser durchlässig sind. Der bisherige strukturelle Einblick in die Claudin-Polymerisation ist begrenzt; es wurden zwar Modelle erstellt, aber nur von einigen wenigen Homopolymeren. Jüngste Studien haben ergeben, dass nur die Hälfte der Claudine Homopolymere bildet, während die Koexpression die Polymerisation bestimmter Claudine fördern kann. Diese Arbeit konzentriert sich daher auf die Regulation der Claudin-Polymerisation. Im ersten Teil der Arbeit wurde die intrinsische Regulation durch einen Vergleich von Claudin-3 und Claudin-4 untersucht. Diese Proteine weisen eine hohe Sequenzhomologie auf, jedoch polymerisiert nur Claudin-3 von sich aus in Fibroblasten. Durch Sequenzabgleich und Molekulardynamik Simulationen konnten wir ein Motiv im zweiten extrazellulären Segment von Claudin-3 bestimmen, welches für eine stabile trans-Interaktion und Polymerisation entscheidend ist. Wir mutierten die beiden Aminosäuren in Claudin-4 entsprechend und konnten beobachten, dass sie die Polymerisation in Fibroblasten fördern. Darüber hinaus zeigte die Claudin-4-Mutante eine verbesserte TJ-Lokalisierung und führte zur (teilweisen) Bildung einer TJ-Barriere mit gekräuselter Morphologie in TJ-defizienten Epithelzellen. Anschließend untersuchten wir die extrinsische Regulation der Claudin-Polymerisation, insbesondere wie die Koexpression von Claudinen die Polymerisation beeinflussen kann. Wir konzentrierten uns auf Claudin-16 und Claudin-19, die im dicken aufsteigenden Teil der Henle-Schleife (TAL) der Niere ein kationenpermeables Copolymer bilden. Mutationen in beiden Proteinen führen zu familiärer Hypomagnesiämie mit Hyperkalziurie und Nephrokalzinose, was ihre wesentliche Rolle beim Ca2+-Transport in der Niere unterstreicht. Wir untersuchten auch Claudin-14, welches bei seiner durch Hyperkalzämie induzierten Expression diese Kationenpore blockieren kann und mit Nierensteinbildung in Verbindung gebracht wird. Es ist bekannt, dass das nicht-polymerisierende Claudin-16 in Claudin-19 Strängen integriert wird, aber wie diese Co-Polymerisation durch Claudin-14 beeinflusst wird, ist noch nicht eindeutig. Mittels hochauflösender Mikroskopie konnten wir in Fibroblasten zeigen, dass Claudin-14 Claudin-16 strangspezifisch ersetzen kann. Dies konnte in Epithelzellen mit endogenem Claudin-16 und im TAL von hyperkalzämischen Mäusen bestätigt werden. Die Expression von Claudin-14 durch Transduktion in Epithelzellen, sowie als Reaktion auf Hyperkalzämie in den Mäusen, führte wiederum zur Substitution von Claudin-16. Zusammengefasst, konnten wir ein Motiv identifizieren, welches die Polymerisation von Claudinen reguliert, und konnten wir zeigen, dass Claudin-16 durch Claudin-14 ersetzt wird, um den Ca2+-Transport in der Niere zu regulieren. Diese Erkenntnisse bilden eine Grundlage für das Verständnis und die Beeinflussung der Claudin-Polymerisation, um beispielsweise die Verabreichung von Medikamenten zu verbessern oder das Eindringen von Krankheitserregern zu verhindern. In kurzfristiger Weise kann das Wissen über den Regulationsmechanismus von Claudin-14 genutzt werden zur Entwicklung von Behandlungen gegen Nierensteine und Hyperkalziurie in anderen Krankheitsbildern.
