Experimentelle Bakteriophagen-Therapie bei Infektionen von Lungenmodellen mit Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Die zunehmende Unwirksamkeit gängiger Medikamente gegenüber immer mehr auftretende multiresistente Bakterien erhöht den Bedarf an neuen Behandlungsmöglichkeiten. Das gramnegative Bakterium Pseudomonas aeruginosa ist ein Beispiel dieser Bakterien, welches für verschiedene nosokomiale Infektionen, insbesondere für Pneumonien, und den rasanten Erwerb von multiplen Resistenzen bekannt ist. Eine vielversprechende mögliche Alternative oder Ergänzung zu herkömmlichen Therapien sind Bakteriophagen, auch bekannt als Phagen. Diese Viren infizieren ausschließlich Bakterienzellen, vermehren sich in ihnen und lysieren sie. Obwohl allgemein anerkannt ist, dass Phagen unter Laborbedingungen in der Lage sind, (antibiotikaresistente) Bakterien zu lysieren, gibt es noch wenig Wissen darüber, welche Immunreaktionen sie im Zielgewebe, wie z. B. der Lunge, auslösen. Die Kenntnis darüber ist jedoch von entscheidender Bedeutung, um die Sicherheit der Phagentherapie beurteilen und sie erfolgreich beim Menschen einsetzen zu können. Das Ziel dieses Promotionsvorhabens war es, in ausgewählten Aspekten die Sicherheit und Verträglichkeit eines Bakteriophagencocktails in der Behandlung gegen eine Lungeninfektion mit P. aeruginosa präklinisch zu evaluieren. Dafür wurden die Bakteriophagen gegen P. aeruginosa ex vivo in einem Lungengewebekultur-Modell und in vivo in einem murinen Pneumonie-Modell untersucht.

Die Applikation der Einzelphagen JG005 und JG024 und eines Phagencocktails, bestehend aus JG005, JG024 und BHZ17, führten im Ex-vivo-Lungeninfektionsmodell zur Hemmung des bakteriellen Wachstums. Dieses Ergebnis konnte nur mit der MOI von 1000 oder höher erzielt werden. Der Einzelphage BHZ17 war bei keiner Dosierung in der Lage, die bakterielle Last in den Lungenstücken zu reduzieren. Die Applikation des Phagencocktails führte bei den mit DSM 107574, einem klinischen Isolat von Pseudomonas aeruginosa, infizierten Lungenstücken zu einer Erhöhung und bei den mit DSM 107570, einem weiteren klinischen Isolat von Pseudomonas aeruginosa, infizierten Lungenstücken zu einer Erniedrigung der IL-1β Ausschüttung.

Durch die Applikation des Phagencocktails konnten keine negativen Einflüsse auf das klinische Bild der Versuchstiere beobachtet werden. Die Phagentherapie führte zu einem verbesserten Körpertemperaturverlauf der infizierten Mäuse und zu weniger Bakterienlast 12 Stunden p.i. in der Lunge und BALF der infizierten Mäuse. Auf die Lungengefäßpermeabilität hatte die Behandlung mit Phagen keinen Einfluss. Mit Hilfe der Phagen konnte die systemische Erhöhung der Leukozytenanzahl durch die Infektion verhindert werden. Auf lokaler Ebene betrachtet, erhöhte die Behandlung mit Phagen den Prozentsatz polymorphkerniger Leukozyten in der bronchioalveolären Lavageflüssigkeit bei scheininfizierten Tieren zu allen Untersuchungszeitpunkten. Die Befunde der lokalen Immunreaktion wurden weiterhin durch die Ergebnisse der histopathologischen Auswertung bestätigt. Dort zeigten die scheininfizierten phagenbehandelten und placebobehandelten Tiere minimale bis geringgradige neutrophile alveoläre sowie perivaskuläre und peribronchiale Infiltrate. Die histopathologische Untersuchung zeigte außerdem keine signifikanten Unterschiede im Hinblick auf Grad der Pneumonie und Ödembildung zwischen der P. aeruginosa-infizierten und phagenbehandelten Gruppe im Vergleich zu der P. aeruginosa-infizierten und Placebo behandelten Gruppe. Durch die Applikation der Phagen kam es teilweise zur Verringerung und teilweise zur Erhöhung von Zytokinen auf lokaler und auf systemischer Ebene. TNF-α und GM-CSF waren in scheininfizierten mit Phagen behandelten Tieren 12 Stunden p.i. auf lokaler Ebene erhöht. Die Applikation der Phagen führte zu einer Reduktion der IL-1β Ausschüttung 12 Stunden p.i. auf lokaler und systemischer Ebene in den mit P. aeruginosa infizierten Tieren.

Die Ergebnisse dieser Studie zeigen die Fähigkeit der Phagen, Bakterienlast zu reduzieren, und damit ihr Potenzial als mögliches Therapeutikum. Trotz des Auftretens von leichten Immunreaktionen in den verschiedenen Modellen konnten keine klinisch sichtbaren unerwünschten Wirkungen im Mausmodell beobachtet werden. Die vorliegende experimentelle Studie unterstützt die Entwicklung eines Cocktails von Bakteriophagen für die klinische Therapie von P. aeruginosa Infektionen der Lunge.

The emergence of multidrug-resistant bacteria and the increasing ineffectiveness of current drugs have created a need for new treatment options. An example of such a bacterium is Pseudomonas aeruginosa, a Gram-negative bacterium known to cause several nosocomial infections, particularly pneumonia, and to rapidly acquire multiple resistance. A promising potential alternative or adjunct to conventional therapies are bacteriophages, also known as phages. These viruses only infect bacterial cells, lyse them, and replicate in the process. Although it is generally accepted that phages can lyse (antibiotic-resistant) bacteria under laboratory conditions, little is known about the immune response they can induce in target tissues such as the lungs. However, understanding this is crucial for assessing the safety of phage therapy and for its successful use in humans. The aim of this doctoral thesis was to preclinically evaluate the safety and tolerability of a bacteriophage cocktail in the treatment of pulmonary infection with P. aeruginosa in selected aspects. The bacteriophages were evaluated against P. aeruginosa ex vivo in a lung tissue culture model and in vivo in a murine pneumonia model.

Application of the single phages JG005 and JG024 and a phage cocktail of JG005, JG024 and BHZ17 resulted in inhibition of bacterial growth in the ex vivo lung infection model. This result was only achieved at an MOI of 1000 or higher. The single phage BHZ17 was unable to reduce the bacterial load in the lung samples at any dose. Application of the phage cocktail led to an increase in IL-1β release in the lung samples infected with DSM 107574, clinical isolate of Pseudomonas aeruginosa, and to a decrease in the lung samples infected with DSM 107570, another clinical isolate of Pseudomonas aeruginosa.

The phage cocktail did not have negative effects on the clinical picture of the experimental animals, but the phages did lead to an improvement in the body temperature of the infected mice. Furthermore, phage treatment resulted in fewer bacteria in the lungs and BALF at 12 hours p.i. of the infected mice. There was no effect of phage treatment on pulmonary vascular permeability. Phages prevented the systemic increase in leukocytes caused by the infection. At the local level, phage treatment increased the percentage of polymorphonuclear leukocytes in bronchioalveolar lavage fluid in sham-infected animals at all study time points. The findings of local immune response were further supported by the results of histopathological evaluation. Both sham-infected phage-treated and placebo-treated animals developed minimal to low-grade neutrophilic alveolar, perivascular and peribronchial infiltrates. The histopathological examination also showed no significant differences in the degree of pneumonia and edema formation between the P. aeruginosa-infected and phage-treated group compared to the P. aeruginosa-infected and placebo-treated group. Phage administration resulted in partial reduction and partial increase of cytokines at local and systemic levels. TNF-α and GM-CSF were increased at the local level 12 hours p.i. in sham-infected phage-treated animals. Application of phages led to a reduction in IL-1β release 12 hours p.i. at local and systemic levels in P. aeruginosa-infected animals.

The results of this study confirm the ability of phages to reduce bacteria burden and thus their potential as a possible therapeutic agent. Despite the occurrence of slight immune responses in the different models, no clinically visible adverse effects were observed in the mouse model. The present study has strengthened the approach of developing a cocktail of bacteriophages for the clinical therapy of lung infections caused by P. aeruginosa.