dc.contributor.author
Winter, Jennifer
dc.date.accessioned
2018-06-07T17:58:07Z
dc.date.available
2003-12-03T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/4485
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-8685
dc.description
0\. Titelblatt, Inhalt, Zusammenfassung, Summary, Ausblick, Abkürzungen,
Danksagung, Publikationen, Lebenslauf
1\. Einleitung 4
2\. Material und Methoden 17
3\. Ergebnisse 44
4\. Diskussion 93
9\. Literatur 118
dc.description.abstract
Das Opitz-Syndrom (OS) ist eine heterogene Erbkrankheit, die durch
Organfehlbildungen der vorderen Mittellinie charakterisiert ist. OS kann
autosomal dominant oder X-chromosomal rezessiv vererbt werden. Der Genlocus
der ersten Form liegt auf Chromosom 22, das krankheitsverursachende Gen wurde
bis jetzt jedoch nicht identifiziert. Die X-chromosomale Form des OS wird
durch Mutationen in dem ubiquitär exprimierten MID1-Gen verursacht. Bisher
konnten für etwa 75% der X-chromosomalen Fälle Mutationen in den kodierenden
Bereichen dieses Gens identifiziert werden, wobei die meisten dieser
Mutationen (68%) im C-terminalen Bereich lokalisiert sind. Die restlichen
Mutationen sind über das gesamte Protein mit Ausnahme des RING-Fingers
verteilt. Das MID1-Gen kodiert für ein RING-Finger-Protein, das neben dem
RING-Finger zwei Bboxen, eine coiled coil Domäne, eine Fibronektin Typ III
Domäne und eine C-terminale B30.2-Domäne enthält. Es besitzt, wie andere RING-
Finger-Proteine auch, Ubiquitin-Ligase Aktivität. Über die 1. BBox bindet es
an eine regulatorische Untereinheit der Mikrotubulus-assoziierten Phosphatase
2A (PP2Ac), das α4-Protein, was zur Übertragung von Ubiquitin auf die PP2Ac
führt. Mikrotubulus-assoziierte PP2Ac wird somit für den Abbau im Proteasom
markiert. Mutiertes MID1-Protein in OS-Patienten hat die Fähigkeit, an
Mikrotubuli zu binden, verloren und kann daher nicht mehr in Kontakt zu
Mikrotubulus-assoziierter PP2A treten. Die Ubiquitinierung von PP2Ac wird
verhindert und PP2Ac akkumuliert in der Zelle. Auf 2D-Gelen konnte im Rahmen
dieser Arbeit eine allgemeine Hypophosphorylierung Mikrotubulus-assoziierter
Zielproteine von PP2Ac in embryonalen Fibroblasten von OS-Patienten gezeigt
werden. Weitere Untersuchungen könnten diese Zielproteine identifizieren und
die Bedeutung ihrer Hypophosphorylierung für die Entstehung von OS klären. Die
Funktion der 2. Bbox des MID1-Proteins war am Anfang dieser Arbeit nicht
bekannt. In Immunfluoreszenz-Experimenten konnte im Rahmen dieser Arbeit ein
entscheidender Einfluß der 2. BBox auf die Bindungsaffinität der 1. BBox an
das α4-Protein nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde durch die Entwicklung
einer auf dem Erkennen von Mutationen in der mRNS basierenden Diagnostik für
OS-Patienten die Voraussetzung geschaffen, die genetischen Defekte in weiteren
Fällen mit X-chromosomalen OS, für die bisher keine MID1-Mutation gefunden
wurde, aufzudecken. So konnte in einer Familie mit X-chromosomalem OS eine
Duplikation von Exon 1 des MID1-Gens identifiziert werden. Durch NMD (durch
vorzeitige Stopkodons vermittelter mRNA-Abbau) kommt es zum Abbau der
MID1-Transkripte in dieser Familie. Ebenfalls unklar war, wie Mutationen in
dem ubiquitär exprimierten MID1-Gen den spezifischen, auf Organe der vorderen
Mittellinie beschränkten, Phänotypen des OS hervorrufen. Zur Aufklärung der
beteiligten Regulationsmechanismen wurden die genomischen Sequenzen des
humanen und des Maus-mid1-Gens untersucht und miteinander und mit der
genomischen Sequenz des Fugu-MID1-Gens verglichen. Sowohl im Menschen als auch
in der Maus und in Fugu konnten zahlreiche alternativ gespleißte Exons
identifiziert werden, die einer entwicklungs- und gewebsspezifischen
Expression unterliegen. Zwischen allen drei Organismen, Mensch, Maus und Fugu
konnte eine funktionelle Konservierung der alternativ gespleißten Transkripte
festgestellt werden. Zum einen konnte die Existenz protein-trunkierender
Transkripte bzw. trunkierter Proteine in den drei Organismen gezeigt werden,
die als dominant-negative Regulatoren der MID1-Protein-Funktion fungieren.
Zweitens wurden in den drei Spezies Mensch, Maus und Fugu alternativ
gespleißte Transkripte identifiziert, die durch das Einführen vorzeitiger
Stopkodons in die jeweiligen Sequenzen über NMD abgebaut werden und darüber
regulatorisch in die MID1-Expression eingreifen. Ausser alternativ gespleißten
Exons konnte im Intron 1 des MID1-Gens eine zwischen Mensch und Maus homologe
Region, Reg 1d, identifiziert werden, die 1.126 bp umfasst. In RT-PCR-
Experimenten konnte gezeigt werden, dass Reg 1d zwar exprimiert wird, jedoch
weder Verbindung zu den MID1-Exons aufweist noch einen eigenen offenen
Leserahmen besitzt. Interessanterweise konnten Northernblot-Analysen zeigen,
dass Reg 1d sowohl vom Sense- als auch vom Antisense-Strang transkribiert
wird. Möglicherweise ist Reg1d eine regulatorische RNA. Weitere Untersuchungen
könnten die regulatorische Verknüpfung von Reg1d und MID1 zeigen und so zur
weiteren Aufklärung der Entstehung des Phänotypen in OS-Patienten beitragen.
de
dc.description.abstract
Opitz BBB/G syndrome (OS) is a heterogenous hereditary disorder that is
characterized by defects in organs derived from the ventral midline. The
inheritance of OS can be autosomal dominant or X-chromosomal recessive. The
gene for the autosomal form of OS has been assigned to chromosome 22, but it
has not been identified yet. The X-chromosomal form of OS is caused by
mutations in the ubiquitously expressed MID1-gene. Mutations in the coding
regions of the MID1-gene account for approximately 75% of X-chromosomal OS
cases. Most mutations (68%) involve the C-terminal part of the protein, and
the remaining mutations are spread all over the protein except for the RING
finger domain. Apart from this domain, the gene product of MID1 consists of
two Bboxes, a coiled coil domain, a Fibronectin type III domain and a
C-terminal B30.2 domain. Like other RING finger proteins, the MID1 protein
shows ubiquitin ligase activity. With its Bbox 1, it binds to a4, a regulatory
subunit of microtubule-associated Phosphatase 2A (PP2Ac) thereby causing
ubiquitination of PP2Ac and its subsequent degradation via the proteasome.
Mutated MID1 protein in OS patients has lost its ability to bind to
microtubules. As a consequence, it cannot interact with microtubule-associated
PP2Ac, ubiquitination of PP2Ac is inhibited and PP2Ac accumulates in the cell.
We could now show overall hypophosphorylation of microtubule-associated target
proteins of PP2Ac in embryonic fibroblasts of an OS patient on 2D gels.
Further investigations will identify these proteins and clarify the biological
relevance of their hypophosphorylation for the natural history of OS syndrome.
The function of the Bbox2 of the MID1 protein and other RBCC-proteins is
unknown. In immunofluorescence experiments that were part of this thesis it
was found that a point mutation in the Bbox2 inhibits the association of the
a4-protein to the microtubules. This indicates that the Bbox2 has a crucial
effect on the binding affinity of Bbox1 to the a4-protein. Beyond this, we
have shown that some of the patients with OS have mutations in the MID1 gene
which cannot be detected by DNA sequencing. Thus, a duplication of exon 1 of
the MID1 gene could be found in one OS-family. A premature termination codon
at the beginning of the second copy of exon 1 destabilizes the mRNA according
to nonsense-mediated mRNA decay. Moreover, I have addressed the question how
mutations in the MID1 gene can lead to the highly tissue-specific OS phenotype
despite ubiquitous expression of the MID1 gene. To shed more light on
mechanisms regulating MID1 protein function, genomic sequences of the human,
the murine and the Fugu MID1 gene were characterized and compared with each
other. Numerous alternatively spliced exons which are subject to tissue- and
developmental specific expression could be identified. A functional
conservation of alternatively spliced transcripts could be shown between the
three organisms, human, mouse and fugu. On the one hand protein-truncating
transcripts or rather truncated proteins that regulate the protein function of
MID1 in a dominant negative manner could be found in all three organisms. On
the other hand, alternatively spliced transcripts that introduce premature
termination codons into the respective sequences and are therefore subject to
NMD could be found in all three organisms. Thereby, these transcripts act as
regulators of MID1 expression. Moreover, a region, Reg1d, with high homology
between man and mouse mapping to intron 1 of the MID1 gene and spanning a
region of 1.126 bp could be identified. Though RT-PCR experiments could show
its expression, Reg1d doesn?t exhibit a connection to any of the MID1 exons.
An open reading frame of significant length could not be detected in Reg1d
transcripts. Interestingly, northernblot analysis could demonstrate
transcription of Reg1d from both strands, sense and antisense, suggesting
Reg1d to function as a regulatory RNA-molecule. Future experiments may show
that Reg1d and MID1 are functionally connected and may further elucidate how
the phenotype in OS patients develops.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
alternative splicing
dc.subject
nonsense mediated mrna decay
dc.subject
regulatory rna
dc.subject
truncated proteins
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Molekulare Charakterisierung des MID1-Gens
dc.contributor.firstReferee
Professor Hans-Hilger Ropers
dc.contributor.furtherReferee
Professor Volker Erdmann
dc.date.accepted
2003-11-14
dc.date.embargoEnd
2003-12-19
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2003003069
dc.title.translated
Molecular characterization of the MID1 gene
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000001145
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2003/306/
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dcterms.accessRights.openaire
open access