Functional characterization of genes that regulate intestinal tumor progression

Abstract

The inner surface of the intestine is covered by a single epithelial cell layer that is subdivided into crypt and villus domains. The mammalian intestinal epithelium constantly renews every 4 to 6 days via stem cells that reside at the bottom of intestinal crypts, while organ size and cellular composition remain steady throughout adulthood. Multiple signaling pathways interact to control intestinal stem cell renewal and tissue homeostasis, and their deregulation can cause tumor formation and progression. To identify novel genes and signaling pathways involved in intestinal tumor progression, I assessed the function of a shortlist of 364 metastasis candidate genes in intestinal cells. To this end, these genes were analyzed in a loss-of-function phenotypic screen in mesenchymal SW480 human colon cancer cells. I screened for genes whose inactivation promoted both an epithelial cell morphology and localization of the epithelial cell adhesion molecule E-cadherin to cell-cell contacts. Among 18 positively tested candidate genes, I identified FGF9 and subsequently established novel roles for FGF signals in transformed and untransformed intestinal cells. In colon cancer cells, silencing of FGF9 or inhibition of FGF receptors induced an epithelial cell morphology and blocked cell motility. These effects were transduced via the MAP kinase pathway, regardless of the existence of an activating KRAS mutation in these colon cancer cells. In line with a proposed function of FGF9 in intestinal tumor cells, I found generalized expression of FGF9 in the tumor epithelium of a subgroup of colon carcinomas. In addition, I identified Fgf9 specifically expressed in Paneth cells of the untransformed mouse small intestine. I therefore also investigated functions of FGF9 in the normal intestine. Using organotypic culture of primary intestine, I found FGF9 to promote intestinal stem cell proliferation leading to an increased number of intestinal stem cells and crypt domains. On the other hand, interference with Fgf9 or general inhibition of FGF receptors resulted in loss of stem cell proliferation, crypt degeneration, and biased specification of intestinal progenitors towards the absorptive cell lineage. These results implicate FGF9 as a growth factor that regulates intestinal stem cell maintenance. The finding of specific expression in Paneth cells that intermingle with stem cells suggests that FGF9 is among the growth factors that constitute the epithelial stem cell niche. Taken together, my studies revealed different functions for FGF signals in the normal and transformed intestinal cells. Interestingly, I found increased FGF9 expression in a subgroup of colon cancer patients, which negatively correlated with patient’s survival. FGF9 could thus have functional roles in colon cancer by regulating tumor cell morphology and/or by regulating the tumor stem cell pool.

Die Innenseite des Darms ist mit einer einzelligen Epithelschicht ausgekleidet, die in Krypten und Villus-Domänen unterteilt ist. Das intestinale Epithel eines Säugetiers erneuert sich kontinuierlich innerhalb von 4 bis 6 Tagen. Die Erneuerung geht von Stammzellen aus, die sich im unteren Teil der Krypten-Domäne befinden. Die Organgröße, sowie die zelluläre Zusammensetzung, bleiben während des gesamten Erwachsendaseins konstant. Eine Vielzahl von Signalwegen interagiert miteinander, um Stammzellerhalt und Gewebehomöostase zu gewährleisten. Eine fehlerhafte Regulierung dieser Signalkaskaden hingegen kann Darmkrebsentstehung bzw. -progression verursachen. Zur Identifizierung neuartiger Gene und Signalwege, die an der Darmkrebsprogression beteiligt sind, habe ich die Funktion von 364 potentiellen Metastasierungsgenen untersucht. Hierzu habe ich eine Funktionsverlust-Phänotyp-Analyse dieser Gene in mesenchymalen SW480 humanen Kolonkarzinom-Zellen durchgeführt. Ich habe die Gene selektiert, deren Inaktivierung eine epitheliale Zellmorphologie bzw. eine membranständige Lokalisierung des Zelladhäsionmolekül E-cadherin in SW480 Zellen hervorgerufen hat. Eines von 18 positiv getesteten Genen war das FGF9-Gen. Im weiteren Verlauf meiner Arbeit habe ich bisher unbekannte Funktionen der FGF-Signale in transformierten und nicht-transformierten intestinalen Zellen aufgedeckt. In Kolonkarzinom-Zellen führte die Hemmung von FGF9 bzw. die Inhibition der FGF- Rezeptoren zu einer epithelialen Zellmorphologie und zur Behinderung von Zellmotilität. Diese Effekte werden durch den MAP-Kinase Signalweg übermittelt, unabhängig von der in dieser Kolonkarzinom Zelllinie vorhandenen aktivierenden KRAS Mutation. Übereinstimmend mit einer vermuteten Funktion von FGF9 in Darmtumoren konnte ich eine erhöhte FGF9-Expression in einigen Kolonkarzinomen nachweisen. Desweiteren habe ich eine spezifische FGF9-Expression in den Paneth-Zellen des Dünndarms von Mäusen detektiert. Da dieses Expressionsmuster auf eine FGF9 Signalaktivität im Normalgewebe schließen lässt, habe ich potentielle Funktionen von FGF9 im Normaldarmepithel untersucht. Mithilfe der organotypischen Primärkultivierung von intestinalem Gewebe konnte ich zeigen, dass FGF9 die intestinale Stammzell-Proliferation anregt, wodurch die Anzahl der Stammzellen bzw. Krypten-Domänen ansteigt. Andererseits führte die Hemmung von Fgf9 oder die Inhibition der FGF- Rezeptoren zur Abnahme der Stammzell-Proliferation bzw. zum Kryptenabbau sowie zu einer Verschiebung der intestinalen Zelltyp-Spezifizierung zu Gunsten der absorbierenden Darmzellen. Diese Ergebnisse identifizieren FGF9 als Wachstumsfaktor, der den Erhalt von intestinalen Stammzellen mitbestimmt. Aufgrund der spezifischen Expression in Paneth-Zellen ist anzunehmen, dass FGF9 zu den Faktoren gehört, die die epitheliale Stammzell-Nische bilden. Zusammengefasst haben meine Untersuchungen verschiedene Funktionen der FGF- Signale in normalen und transformierten Darmzellen aufgedeckt. Interessanterweise zeigte sich bei einer Darmkrebs-Patientengruppe mit erhöhter FGF9 Expression eine im Durchschnitt geringere Lebenserwartung. Dieses Ergebnis legt die Vermutung nahe, dass FGF9 Darmkrebs sowohl durch die Regulierung der Tumor-Zellmorphologie als auch durch Einflussnahme auf die Anzahl der Tumor-Stammzellen funktional beeinflussen kann.