Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, Wege aufzuzeigen, die die gezielte Einführung unnatürlicher Aminosäuren in Proteine mit der Methodik des Einsatzes chemisch aminoacylierter amber-Suppressor-tRNAs verbessern. Um die besonderen Bedingungen beim Einsatz von amber-Suppressor-tRNAs in der zellfreien Proteinbiosynthese zu beleuchten, wurden sowohl in vivo exprimierte als auch in vitro transkribierte amber-Suppressor-tRNAs auf unterschiedlichen Funktionsebenen innerhalb eines Escherichia coli in vitro-Translationssystems charakterisiert. Letztendlich ermöglichten die Untersuchungen eine Einstufung der Suppressionseffizienz von sieben verschiedenen in vitro transkribierten amber-Suppressor-tRNA-Spezies.
Die zielgerichtete Insertion einer unnatürlichen Aminosäure in ein Protein konnte innerhalb der vorliegenden Arbeit anhand der Insertion von ?-Dansyl- Lysin in FABP demonstriert werden. Nicht unerwartet war der Einbau der unnatürlichen Aminosäure äußerst ineffizient. Als eine weitere Limitation der dem Einbau unnatürlicher Aminosäuren zugrunde liegenden Methodik erwies sich die Aufreinigung größerer Mengen an homogenen in vitro transkribierten verkürzten tRNAs, die für die Herstellung der mit der unnatürlichen Aminosäure beladenen tRNA eine unabdingbare Voraussetzung ist. Die Aufreinigung homogener tRNAs war aufgrund der starken 3'-Endheterogenität der Transkriptionsprodukte äußerst problematisch. Sowohl die Homogenität der tRNA als auch die absolute Ausbeute ließen sich deutlich verbessern, indem die normalerweise für die Transkription mit T7-RNA-Polymerase gebräuchliche Temperatur von 37°C auf ein Optimum von 44°C erhöht wurde. Zudem zeigten unterschiedliche Präparationen von T7-RNA-Polymerase verschieden starke n+1-Aktivitäten.
Zur Untersuchung der Aktivitäten in vivo exprimierter amber-Suppressor-tRNAs, wurden Gesamt-tRNA-Präparationen aus insgesamt 10 verschiedenen, bei Kleina et al. (1990) beschriebenen Escherichia coli-amber-Suppressor-Zellstämmen in der in vitro-Translation eingesetzt. Die Relationen in den Suppressionsaktivitäten der amber-Suppressor-tRNAs für Leucin, Histidin, Tyrosin und Serin entsprachen denen in vivo. Die geringere Suppressionsaktivität anderer untersuchter amber-Suppressor-tRNAs in vitro gibt möglicherweise einen Hinweis darauf, daß die Aktivität einiger Aminoacyl- tRNA-Synthetasen im in vitro Translationssystem reduziert ist.
Prozessierung, Reparatur und Aminoacylierung in vitro transkribierter tRNAs und ihre Beziehung untereinander wurden eingehend untersucht. Homogene tRNA- Präparationen mit korrektem CCA-Ende konnten durch eine Prozessierung oder durch die Regeneration des 3'-Endes der in vitro transkribierten tRNAs in der S100-Enzymfraktion des Translationssystems erhalten werden. Die Prozessierung verlängerter tRNAs und die Reparatur verkürzter tRNAs innerhalb des Gesamtsystems erwiesen sich als nicht limitierend für die Proteinbiosynthese.
Letztendlich konnte die unterschiedliche Suppressionsaktivität der Transkripte von sieben amber-Suppressor-tRNA-Spezies (tRNASerCUA {su+1}, tRNATyrCUA {su+3}, tRNALeuCUA {su+6}, tRNALeu5CUA, tRNAPheCUA, tRNAHisCUA und tRNAAla1CUA) auf strukturelle Eigenschaften der entsprechenden Aminoacyl- tRNAs zurückgeführt werden. Als Maß für die Suppressionseffizienz diente die Häufigkeit der ribosomalen tRNA-Selektion im Vergleich zur Häufigkeit der Selektion von RF1. Alle untersuchten amber-Suppressor-tRNAs enthielten die als ideal für die Suppression beschriebene Nukleotidfolge 5'C34U35A36A37A383' innerhalb ihrer Anticodonschlaufe. Auch in Anwesenheit dieser Sequenz unterschieden sich die Suppressionseffizienzen der einzelnen amber-Suppressor- tRNAs sehr stark. Die Rate der tRNA-Selektion des stärksten Suppressors, tRNASerCUA, war über 20 mal so hoch wie die Rate der tRNA-Selektion für tRNAAla1CUA, die die Suppressionseffizienz der zur Zeit für die Einführung unnatürlicher Aminosäuren verwendeten amber-Suppressor-tRNAs repräsentiert. Generell war die Suppressionseffizienz um so besser, je mehr die Sequenz der ursprünglichen Wildtyp-tRNA der Sequenz der aus ihr abgeleiteten amber- Suppressor-tRNA ähnelte. Mit zunehmender Anzahl der Mutationen, die nötig waren, die Sequenz 5'C34U35A36A37A383' innerhalb der Anticodon-Schlaufe zu erhalten, nahm die Suppressionseffizienz der tRNAs ab. Insofern unterstützen die Ergebnisse die Theorie des "Extended Anticodon" (Yarus 1982). Die beiden mit Abstand besten Suppressoren tRNASerCUA und tRNATyrCUA enthalten die Base C32 innerhalb der Anticodon-Schlaufe. Wichtige Strukturelemente für die Suppression liegen möglicherweise auch außerhalb des Anticodon-Armes. Es ergaben sich Hinweise darauf, daß eine TypII-Struktur der tRNA die Suppression begünstigt.
Die im Rahmen der Biotechnologie bedeutendste Konsequenz aus der vorliegenden Arbeit ist, daß die zur Zeit für die Einführung unnatürlicher Aminosäuren in Proteine verwendeten amber-Suppressor-tRNAs relativ schwache amber- Suppressoren sind. Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit sollte die Konstruktion wesentlich verbesserter amber-Suppressoren und damit eine sehr viel effizientere Insertion unnatürlicher Aminosäuren in Proteine möglich sein.
[if !supportEmptyParas] [endif]
The introduction of unnatural amino acids into proteins can be achieved by the use of an amber suppressor tRNA, that has been chemically acylated with the desired amino acid and that is not a substrate for the natural aminoacyl tRNA synthetases. The addition of the charged amber suppressor tRNA to the protein biosynthesis reaction results in site specific incorporation of the amino acid into the protein. However very often the usually applied methodology does not lead to sufficient amounts of mutant protein. The goal of this work was to expand our knowledge of in vitro amber suppression expecting that the strategy mentioned above can be applied more general.
Within the presented work the site specific incorporation of an unnatural amino acid could be demonstrated by the introduction of ?-dansyl lysine into FABP (fatty acid binding protein). As expected the incorporation of the unnatural amino acid was very inefficient. A further limitation of the methodology proved to be the preparation of large amounts of shortened tRNA molecules, which are necessary to produce the chemically acylated tRNA. The high level of 3'-end heterogeneity of the in vitro transcription products strongly impedes the purification of homogenous tRNA. The homogeneity and the amount of the tRNAs during T7-transcription could clearly be improved by increasing the reaction temperature from 37°C to an optimum temperature of 44°C. Additionally, various preparations of T7-RNA-Polymerase showed different n+1-activities.
To investigate the activities of amber suppressor tRNAs expressed in vivo, total tRNA from 10 different Escherichia coli amber suppressor strains (Kleina et al. 1990) was prepared and employed in cell-free translation. The relations between the suppression activities of the amber suppressors for leucine, histidine, tyrosine and serine in vitro corresponded to the in vivo results of other authors. In contrast to those four the suppression activities of other amber suppressors were decreased in vitro indicating that the activities of the corresponding amino acyl tRNA synthetases may be reduced.
Processing, repair and aminoacylation of in vitro transcribed tRNAs and the relation of these processes to each other were investigated in-depth. Incubation of 3'-shortened or 3'-prolonged heterogenous in vitro transcription products in the S100 enzyme fraction of the total translation system resulted in homogenous tRNA populations with correct 3'-terminal CCA-ends. Processing of prolonged tRNAs and repair of shortened tRNAs in the whole translation system were shown not to be limiting for protein biosynthesis in vitro.
The suppression activities of the transcripts of seven different amber suppressor tRNA species (tRNASerCUA {su+1}, tRNATyrCUA {su+3}, tRNALeuCUA {su+6}, tRNALeu5CUA, tRNAPheCUA, tRNAHisCUA and tRNAAla1CUA) were shown not to be limited by aminoacylation. Therefore the suppression activities of these tRNAs reflects structural properties of their aminoacylated counterparts. Suppression efficiency was defined as the frequency of ribosomal tRNA selection divided by the frequency of RF1 selection. The anticodon loops of all tRNAs contained the sequence 5'C34U35A36A37A383' which is ideal for efficient suppression as known from other studies. Still, in the presence of this sequence suppression efficiencies varied over a large range. The rate of tRNA selection was 20 times higher for the strongest suppressor, tRNASerCUA, compared to the efficiency of the weakest one, tRNAAla1CUA, which represents the suppression efficiency of the actual tRNAs used for chemical aminoacylation. In general the more the sequence of the amber suppressor tRNA reflected the sequence of the original wild type tRNA, from which it was deviated, the better the suppression efficiencies became. With increasing number of nucleotide exchanges, that were necessary to get the sequence 5'C34U35A36A37A383' into the anticodon loop of the amber suppressor, suppression efficiencies decreased, indicating that tRNA sequences have been evolved to support optimal interaction between codon and anticodon, as it is postulated in the "Extended Anticodon" (Yarus 1982). The two best amber suppressors by far, tRNASerCUA and tRNATyrCUA, both contain the base C32 inside their anticodon loop. There is also some evidence, that certain structural features important for suppression are localized outside the anticodon arm and that these structural features are found mainly in typeII- tRNAs.
The most important conclusion resulting from this work within the field of biotechnology is, that the actual amber suppressor tRNAs used for chemical aminoacylation are comparably weak suppressors. A logical step from this work is the construction of new amber suppressor tRNAs with higly improved suppression efficiences for chemical aminoacylation. Therefore the present work should allow a much improved incorporation of unnatural amino acids into proteins in the future.
