Die Auswirkungen des binären Clostridioides difficile Toxins CDT auf die epitheliale Barriere

Abstract

Einleitung: Clostridioides difficile ist die häufigste Ursache antibiotikaassoziierter Diarrhöen. Hypervirulente C. difficile-Stämme produzieren zusätzlich zu den Toxinen TcdA und TcdB das binäre Toxin CDT. Eine Infektion mit diesen CDT-produzierenden Stämmen ist mit einem erhöhten Risiko für einen schwerwiegenden Krankheitsverlauf assoziiert. Die epitheliale Barriere wird durch Tight-Junction-Proteine ausgebildet und ist häufig Zielstruktur bakterieller Toxine. Ziel dieser Arbeit ist daher die Untersuchung der Wirkung des CDT auf die epitheliale Barriere. Methode: HT-29/B6-GR/MR-Monolayer wurden mit subtoxischen Konzentrationen von CDT behandelt. Eine funktionelle Charakterisierung der epithelialen Barriere erfolgte durch die Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TER) und der Permeabilität für die Makromoleküle Fluorescein (332 Da) und FITC-Dextran (4 kDa). Eine mögliche Induktion von Nekrosen wurde mit einem LDH-Release-Assay und eine mögliche Apoptoseinduktion mit einem TUNEL-Assay analysiert. Die Proteinexpression verschiedener Tight Junction (TJ)-Proteine wurde mittels Western Blot untersucht. Eine Analyse der Lokalisation und Zusammensetzung verschiedener TJ-Proteine erfolgte mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie und hochauflösender STED-Mikroskopie. Ergebnisse: Subtoxische Konzentrationen des C. difficile-Toxins CDT bewirkten eine funktionelle Störung der epithelialen Barriere mit reduziertem TER und erhöhter Permeabilität für die Makromoleküle Fluorescein und FITC-Dextran. In den verwendeten Konzentrationen war keine relevante Induktion von Nekrose und Apoptose und keine veränderte Expression der untersuchten TJ-Proteine nachzuweisen. Molekulares Korrelat für die Barrierestörung hingegen war eine subzelluläre Umverteilung der TJ-Proteine Trizellulin, Occludin und Claudin-4 und eine perijunktionale Kondensation des Aktin-Zytoskeletts. Die Effekte des CDT auf die epitheliale Barriere konnten durch Inhibition der Myosin-leichte-Ketten-Kinase MLCK verhindert werden. Diskussion: Subtoxische Konzentrationen des CDT beeinträchtigen die funktionelle Integrität der epithelialen Barriere durch eine MLCK-vermittelte gestörte Lokalisation von barrierebildenden TJ-Proteinen. Ein veränderter Phosphorylierungsstatus und ein Calciumeinstrom stellen mögliche Ursachen für eine CDT-vermittelte Aktivierung der MLCK dar. Diese Barrierestörung, insbesondere die Öffnung des parazellulären Durchtrittsweges für Makromoleküle, ist ein Erklärungsansatz für die Hypervirulenz von CDT-produzierenden C. difficile-Stämmen. Als weitere mögliche Ursachen der Hypervirulenz werden die CDT-vermittelte Zytotoxizität, eine veränderte Expression der Toxine TcdA und TcdB, die Wirkung des CDTb als porenformendes Toxin, ein Durchtritt von luminalen Antigenen im Sinne des Leaky-Gut-Konzeptes ein erleichterter Rezeptorzugang für die Toxine TcdA und TcdB diskutiert.

Introduction: Clostridioides difficile is the most common cause of antibiotic-associated diarrhea. Hypervirulent C. difficile strains produce, in addition to toxins TcdA and TcdB, the binary toxin CDT. An infection with these CDT-producing strains is associated with an increased risk of a severe disease course. The epithelial barrier is formed by tight junction proteins and is often the target structure of bacterial toxins. Therefore, the aim of this study is to investigate the effect of CDT on the epithelial barrier. Methods: HT-29/B6-GR/MR monolayers were treated with subtoxic concentrations of CDT. Functional characterization of the epithelial barrier was performed by measuring transepithelial electrical resistance (TER) and the permeability to the macromolecules fluorescein (332 Da) and FITC-dextran (4 kDa). Potential induction of necrosis was analyzed using an LDH release assay. Potential apoptosis induction was assessed using TUNEL assay. The expression level of various tight junction (TJ) proteins was examined by Western blotting. Analysis of the subcellular localization of different TJ proteins was performed using confocal laser-scanning microscopy and high-resolution STED microscopy. Results: Subtoxic concentrations of the C. difficile toxin CDT resulted in a functional disruption of the epithelial barrier, characterized by reduced TER and increased permeability to macromolecules such as fluorescein and FITC-Dextran. At the concentrations used, there was no relevant induction of necrosis and apoptosis, and no altered expression of the examined TJ proteins could be detected. The molecular correlate for the barrier disruption, however, was a subcellular redistribution of the TJ proteins tricellulin, occludin and claudin-4, as well as perijunctional condensation of the actin cytoskeleton. The effects of CDT on the epithelial barrier could be prevented by inhibiting the Myosin Light-Chain Kinase (MLCK). Discussion: Subtoxic concentrations of CDT impaired the functional integrity of the epithelial barrier through MLCK-mediated de-localization of barrier-forming TJ proteins. An altered phosphorylation status and calcium influx are potential causes for CDT-mediated MLCK activation. This barrier disruption, particularly the opening of the paracellular passage for macromolecules, provides an explanation for the hypervirulence of CDT-producing C. difficile strains. Other potential causes of hypervirulence discussed include CDT-mediated cytotoxicity, altered expression of the toxins TcdA and TcdB, the poreforming effect of CDTb, the passage of luminal antigens in line with the Leaky Gut concept, and facilitated receptor access for the toxins TcdA and TcdB.