Störung der intestinalen epithelialen Barrierefunktion durch Microcystin in Caco-2-Zellen

Abstract

Cyanobakterien, auch bekannt als Blaualgen, sind photosynthetische gramnegative Bakterien. Sie gehören zu den ältesten Lebensformen der Welt und sind in verschiedenen aquatischen Umgebungen zu finden. Cyanobakterienblüten sind aufgrund von Faktoren wie dem globalen Temperaturanstieg und der erhöhten Verfügbarkeit von Stickstoff aus Quellen wie Düngemitteln immer häufiger anzutreffen. Diese Algenblüten können ein Gesundheitsrisiko für Menschen, Tiere und Wasserlebewesen darstellen. Microcystin, ein weit verbreitetes Toxin, das von Cyanobakterien produziert wird, löst bei oraler Aufnahme aufgrund seiner Auswirkungen auf die Darmfunktion Durchfallerscheinungen aus. Unterschiedliche Diarrhömechnismen, wie sekretorische oder malabsorptive Durchfalltypen oder die Durchfallentstehung durch eine Undichtigkeit des Epithels wurden für die Vergiftung mit Microcystin diskutiert, aber bisher nicht ausreichend untersucht. Ziel dieser Studie war es in einem experimentellen Modell menschlicher Dünndarmepithelzellen (Caco-2) den zugrunde liegenden Mechanismus aufzuklären, durch den Microcystin zu Durchfall führt. Wir führten funktionelle und molekulare Analysen an mit Microcystin behandelten Caco-2-Epithelmonolayern durch, um die Barrieredysfunktion zu untersuchen. Unsere Analysen konzentrierten sich auf die Untersuchung von Veränderungen der Tight Junctions (TJs) und Zellschäden, die mit funktionellen Veränderungen im transepithelialen elektrischen Widerstand (TER) korrelieren. Nach einer 24-stündigen Microcystin-Exposition verringerte sich der TER in Caco-2-Zellen im Vergleich zum Ausgangswert um 65 %, während gleichzeitig die Permeabilität für Fluorescein auf das 2,6-fache anstieg. In der Western-Blot-Analyse wurde eine Verringerung der Claudin-1-Expression, jedoch keine Veränderungen der Claudin-3 und -4-Expression festgestellt. Mit Hilfe der hochauflösenden STED-Mikroskopie konnten wir feststellen, dass die Integrität der TJs beeinträchtigt war, gekennzeichnet durch das Ausfransen und Aufspalten der TJ-Domäne in den Epithelzellen, während die epitheliale Apoptose nicht wesentlich zur Störung der epithelialen Barriere beitrug. Stattdessen war die Einschnürung des Zytoskeletts mit dem Zerfall der TJ und der Entwicklung des Barrieredefekts verbunden. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die Behandlung der Caco-2-Zellen mit spezifischen MLCK-Inhibitoren die Auswirkungen des Toxins auf die Barrierefunktion aufhob. Folglich deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass MLCK-abhängige Veränderungen der TJ der primäre Pathomechanismus sind, der für den "Leak-Flux"-Typ der Diarrhöe verantwortlich ist. Ein neuartiger Ansatz für das Screening von Signalwegen könnte die RNA-Sequenzierung mit bioinformatischer Analyse der mit Microcystin behandelten Zellen umfassen. Weitere Grundlagenforschung zur Regulierung des Zytoskeletts und der TJ durch Proteinphosphatase-Regulationsmechanismen könnte relevante Ergebnisse und Gegenmaßnahmen zur Vergiftung mit Microcystin liefern.

Cyanobacteria, also known as blue-green algae, are photosynthetic Gram-negative bacteria. They are among the oldest life forms on Earth and are commonly found in various aquatic environments. Cyanobacterial blooms have become increasingly common due to factors such as rising global temperatures and increased nitrogen availability from sources like fertilizers. These algae blooms can pose health risks to humans, animals, and aquatic life. Microcystin, a common toxin produced by cyanobacteria, causes diarrhea when ingested orally due to its effects on intestinal function. Different diarrhea mechanisms, such as secretory or malabsorptive types of diarrhea or diarrhea caused by leakage of the epithelium, have been discussed for microcystin poisoning but have not been adequately investigated. The aim of this study was to elucidate the underlying mechanism by which microcystin leads to diarrhea in an experimental model of human small intestinal epithelial cells (Caco-2). We conducted functional and molecular analyses on microcystin-treated Caco-2 epithelial monolayers to investigate barrier dysfunction. Our assessment focused on investigating alterations in tight junctions (TJs) and cell damage that correlate with functional changes in transepithelial electrical resistance (TER). Following 24 hours of exposure to microcystin, TER in Caco-2 cells decreased by 65% compared to its initial value, while simultaneously, the permeability to fluorescein increased 2.6-fold. A reduction in claudin-1 expression, with no changes in claudin-3 and -4 expression was observed in Western blot analysis. Employing super-resolution STED microscopy, we could find that the integrity of TJs was compromised, characterized by the fraying and splitting of the TJ domain in the epithelial cells while epithelial apoptosis did not substantially contribute to the disruption of the epithelial barrier. Instead, cytoskeletal actomyosin constriction was associated with TJ disintegration and the development of the barrier defect. In addition, we demonstrated that treatment of Caco-2 cells with specific MLCK inhibitors abolished effects of the toxin on barrier function. Consequently, our results suggest MLCK-dependent changes of the TJ as the primary pathomechanism responsible for the "leak flux" type of diarrhea. A novel approach for screening signaling pathways could involve RNA-sequencing of microcystin-treated cells, followed by bioinformatics pathway analysis. Further foundational research into cytoskeletal and TJ regulation through protein phosphatase regulatory mechanisms could provide relevant results and countermeasures for microcystin poisoning.