Analysis of nephrotoxic changes induced by calcineurin inhibitors in a rat model

Abstract

Background: Calcineurin inhibitors (CNI) such as cyclosporine A (CsA) and tacrolimus (Tac, FK506) are commonly used as immunosuppressive drugs in patients with solid organ transplantation or autoimmune affections. With merits undisputed at short-term, their chronic use leads to nephrotoxicity in a significant proportion of renal or non-renal transplant recipients, resulting in compromised kidney function. Although attempts have been made to substitute CNIs with other immunosuppressants, the alternatives to CNIs are generally considered less effective. CsA has been considered more toxic than Tac, but the current preference for Tac over CsA needs further validation. Understanding the cellular mechanisms of their particular nephrotoxicity profiles should enable more personalized treatment protocols to minimize adverse effects. We therefore aimed to investigate whether CsA and Tac exhibit distinct renal damage patterns. Systemic and kidney parameters were studied in rats exposed to chronic CNI delivery. Methods: Wild-type male Wistar rats (group size n=6 to 12) were treated with vehicle, CsA (30 mg/kg/day) or Tac (2 mg/kg/day) via subcutaneously implanted osmotic minipumps for 28 days. Histopathology and advanced microscopy techniques such as large-scale electron microscopy and 3D-structured illumination microscopy were used tissue analyses. Standard biochemistry, RNA sequencing as well as proteomic and phosphoproteomic analyses were conducted to identify molecular changes. Results: Distinct damage patterns were observed in the CNI treatment groups compared to vehicle. Alterations were located in vasculature and nephron. Cells of the glomerular filtration barrier revealed displayed more damage by Tac than by CsA, with changes located in pore endothelium and podocytes. The VEGF/VEGFR2 pathways as well as podocyte-specific gene expression were substantially and differentially altered. Contrastingly, the renal tubule was more severely affected by CsA than by Tac with prominent lysosomal dysfunction, impaired proteostasis, oxidative stress and enhanced apoptosis chiefly observed in the early proximal nephron. Conclusion: We found that pathological changes in renal microenvironments were specific to each treatment. If our findings can be translated to the clinical context, the choice of CNI should consider individual risk factors related to renal vasculature and tubular epithelia. As a step in this direction, we present identified products and pathways from multiomics analyses with potential pathognomonic relevance.

Hintergrund: Calcineurin-Inhibitoren (CNI) wie Cyclosporin A (CsA) und Tacrolimus (Tac, FK506) werden häufig als Immunsuppressiva bei Patienten mit Organtransplantation oder Autoimmunerkrankungen eingesetzt. Obwohl ihre Vorzüge kurzfristig unbestritten sind, führt ihre chronische Anwendung bei einem erheblichen Teil der Empfänger von Nieren- oder Nicht-Nierentransplantaten zu Nephrotoxizität, die zu signifikanter Beeinträchtigung der Nierenfunktion führen kann. Obwohl Versuche unternommen werden, CNI durch andere Immunsuppressiva zu ersetzen, gelten die Alternativen zu CNI im Allgemeinen als weniger wirksam. CsA gilt als toxischer als Tac, die derzeitige Bevorzugung von Tac gegenüber CsA bedarf jedoch weiterer Bestätigung. Das Verständnis der zellulären Mechanismen ihrer jeweiligen Nephrotoxizitätsprofile sollte personalisierte Behandlungsprotokolle fördern, um Nebenwirkungen zu minimieren. Unser Ziel war es daher zu untersuchen, ob CsA und Tac unterschiedliche Nierenschädigungsmuster aufweisen. Systemische und Nierenparameter wurden bei Ratten untersucht, die einer chronischen CNI-Verabreichung ausgesetzt waren. Methoden: Männliche Wildtyp-Wistaratten (Gruppengröße n=6 bis 12) wurden über subkutan implantierte osmotische Minipumpen 28 Tage lang mit Vehikel, CsA (30 mg/kg/Tag) oder Tac (2 mg/kg/Tag) behandelt. Für Gewebeanalysen wurden Histopathologie und moderne Mikroskopietechniken wie Large scale Elektronenmikroskopie und 3D-structured illumination Mikroskopie verwendet. Zur Identifizierung molekularer Veränderungen wurden grundlegende Biochemie, RNA-Sequenzierung sowie proteomische und phosphoproteomische Analysen durchgeführt. Ergebnisse: In den CNI-Behandlungsgruppen wurden im Vergleich zur Vehikelgabe deutliche Schadensmuster beobachtet. Beide Medikamente verursachten erhebliche, aber unterschiedliche Schäden im Gefäßsystem und im Nephron. Komponenten der glomerulären Filtrationsbarriere wurden durch Tac stärker beeinträchtigt als durch CsA, was zu erheblichen Beeinträchtigungen des Porenendothels und der Podozyten, vereint mit geschwächter VEGF/VEGFR2-Signalübertragung und verminderter podozytenspezifischen Genexpression, führte. Im Gegensatz dazu wurde der Nierentubulus durch CsA stärker beeinträchtigt als durch Tac, wobei ausgeprägte lysosomale Dysfunktion, beeinträchtigte Proteostase, oxidativer Stress und verstärkte Apoptose hauptsächlich im frühen proximalen Nephron beobachtet wurden. Schlussfolgerung: Wir fanden heraus, dass pathologische Veränderungen im Nierenparenchym für jede Behandlung spezifisch waren. Mit Bezug auf den klinischen Kontext sollten unsere Ergebnisse dazu verhelfen, bei der Wahl geeigneter Immunsuppressiva individuelle Risikofaktoren im Zusammenhang mit Nierengefäßen und tubulären Epithelien zu berücksichtigen. Als Schritt in diese Richtung stellen wir identifizierte Produkte und Signalwege aus den Multiomics-Analysen mit potenzieller pathognomonischer Relevanz vor.