Untersuchungen über das Vorkommen von gastrointestinalen Parasiten bei Pferden in Berlin und Brandenburg

Abstract

Infektionen mit gastrointestinalen Parasiten beim Pferd zeigen weltweit eine hohe Prävalenz und insbesondere parasitierende Helminthen mit hoher Pathogenität für den Wirt, wie Strongylus spp. und speziell Strongylus vulgaris, sind von veterinärmedizinischer Bedeutung. Ein gezieltes Betriebsmanagement mit effektiven Strategien zur Kontrolle von Endoparasiten sowie ein verantwortungsbewusstes und wirksames anthelminthisches Behandlungsmanagement, welches aufgrund der Verbreitung von Resistenzen gegen Anthelminthika heute eine Herausforderung darstellt, erfordern genaue Kenntnisse über das regionale Vorkommen von Helminthen und potenzielle Risikofaktoren. Das Ziel dieser Studie war es daher, die Prävalenz von gastrointestinalen Parasiten, mit Fokus auf kleine und große Strongyliden sowie auf Bandwürmer, in den regionalen Pferdebeständen unter Verwendung verschiedener direkter und indirekter Nachweismethoden zu beschreiben und anhand der gewonnenen Daten Risikofaktoren zu identifizieren, die mit equinen Helmintheninfektionen assoziiert werden. Im Rahmen dieser Dissertation wurden Proben von 48 pferdehaltenden Betrieben in Berlin und Brandenburg gesammelt. In dem Zeitraum von Mai 2017 bis Januar 2018 wurden Kot-, Blut- und Speichelproben von 484 Pferden entnommen. Die Kotproben individueller Pferde wurden zum Nachweis einer patenten Infektion mit Nematoden oder Cestoden mittels quantitativem mini-FLOTAC und der semi-quantitativen kombinierten Sedimentation-Flotation untersucht. Bei koproskopisch positivem Nachweis von Eiern der Magen-Darm-Strongyliden (MDS) wurde eine Larvenkultur auf Einzeltierebene und eine DNA-Isolation durchgeführt. Anschließend wurden PCRs zum Nachweis von Pan-Nematoden-DNA und eine S. vulgaris-spezifische real-time PCR durchgeführt. Zudem wurde eine real-time PCR mit hochauflösender Schmelzkurvenanalyse zur Speziesdifferenzierung von Strongylus edentatus, Strongylus equinus und Strongylus asini in diesem Projekt entwickelt. Die S. vulgaris-positiven Proben wurden in einem eigens konzipierten Pyrosequencing Assay auf Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) in den Codons 167, 198 und 200 des β-Tubulin-Gens vom Isotyp 1 untersucht, die mit dem Auftreten von Benzimidazol-Resistenzen in Nematoden assoziiert werden. Zum Nachweis Anoplocephala spp.-spezifischer Antikörper wurden serum- und speichelbasierte ELISAs durchgeführt. Außerdem wurde das Blutserum mittels ELISA auf S. vulgaris-spezifische Antikörper untersucht. Koproskopisch wurde in 66,7 % der Proben Eier vom MDS-Typ nachgewiesen. Weiterhin wurden Eier von Oxyuris equi, Anoplocephala spp. und Parascaris spp. in 1,2 %, 0,6 % und 0,4 % der Kotproben identifiziert. In den Proben von vier Pferden konnte mittels real-time PCR DNA von S. vulgaris detektiert werden. Diese Proben zeigten weder bei der Pyrosequenzierung noch bei der Sanger Sequenzierung SNPs auf, die bei Nematoden mit Benzimidazol-Resistenzen in Verbindung gebracht werden. Die Ergebnisse der real-time PCR mit Schmelzkurvenanalyse zeigen den Nachweis von S. edentatus DNA in zehn Pferdeproben. Ein positiver Nachweis von Antikörpern gegen Anoplocephala spp. erfolgte bei 16,2 % der Serumproben, woraus sich eine Betriebsprävalenz von 52,1 % ergibt, und in 29,5 % der Speichelproben, was einer Betriebsprävalenz von 75,7 % entspricht. Unter Verwendung eines konservativen Cut-off-Werts mit einer Sensitivität von 43 % und Spezifität von 96 % zeigten sich insgesamt 21,2 % der Serumproben positiv für Antikörper gegen S. vulgaris Larven, was einer Prävalenz von 83,3 % auf Betriebsebene entspricht. Logistische Regressionsanalysen wurden erstellt, um Risikofaktoren für den positiven Antikörpernachweis im serumbasierten Anoplocephala spp.-ELISA und dem S. vulgaris-ELISA sowie für die Ausscheidung von MDS-Eiern zu bestimmen. In allen Analysen zeigte sich insbesondere ein limitierter Weidezugang als ein schützender Faktor. Große Weideflächen, regelmäßige Weidewechsel und eine hohe Anzahl MDS-Eier pro Gramm Kot wurden als Risikofaktoren für eine positive Serum-Antikörperreaktion auf Anoplocephala spp. identifiziert, während das gleichzeitige Vorhandensein von Fohlen und eine hohe Anzahl von Pferden im Betrieb sowie die letzte Behandlung mit Praziquantel schützend wirkten. Ein großer zeitlicher Abstand zu der letzten anthelminthischen Behandlung erhöhte das Risiko der Ausscheidung von MDS-Eiern, während die Verwendung von Moxidectin und Ivermectin bei der letzten Behandlung sowie ein höheres Alter der Pferde das Risiko der Eiausscheidung verringerte. Das Alter erwies sich auch als protektiver Faktor für einen S. vulgaris-seropositiven Befund, wohingegen ein selektives Behandlungsschema als Risikofaktor eingestuft wurde. Die Ergebnisse zum Nachweis von gastrointestinalen Helminthen bei Pferden unterscheiden sich in dieser Studie in Abhängigkeit von der verwendeten Nachweismethode, wobei die Ergebnisse der ELISAs deutlich höhere Prävalenzen von Anoplocephala spp. und S. vulgaris nahelegen als bei dem direkten Nachweis mittels koproskopischer Methoden oder PCR. Auch durch die Einstufung der selektiven Entwurmung als Risikofaktor für S. vulgaris-Antikörper zeigt sich, dass eine evidenzbasierte anthelminthische Behandlungsstrategie von der Anwendung zusätzlicher Nachweismethoden profitieren kann. Es empfiehlt sich daher, die parasitologische Untersuchung mittels gängiger Flotationsmethoden durch spezifische Tests auf das Vorhandensein von S. vulgaris oder Anoplocephala spp. in der Herde zu ergänzen. Doch neben dem Monitoring durch diagnostische Maßnahmen und der anthelminthischen Behandlung können insbesondere präventive Managementmaßnahmen, wie ein angepasstes Weidemanagement, zur Reduzierung des Endoparasitendrucks bei Pferden beitragen.

Infections with gastrointestinal parasites of horses show a high prevalence worldwide and especially parasitic helminths that are highly pathogenic, such as Strongylus spp. and in particular Strongylus vulgaris, are of veterinary importance. Farm management with effective endoparasite control strategies as well as sustainable and effective anthelmintic management, which is currently challenging due to the spread of anthelmintic resistance, require detailed knowledge of the regional occurrence of helminths and potential risk factors. The aim of this study was therefore to describe the prevalence of gastrointestinal parasites in regional equine populations, focusing on small and large strongyles and tapeworms. The intent was to utilize different direct and indirect detection methods and to identify risk factors associated with equine helminth infections based on the data obtained. For this project samples were collected from 48 farms in the German federal states Berlin and Brandenburg. Faeces, blood and saliva samples were collected from 484 horses between May 2017 and January 2018. The faecal samples from individual horses were tested for patent infections with nematodes or cestodes using the quantitative mini-FLOTAC and semiquantitative combined sedimentation-flotation techniques. Larval culture on individual level and DNA isolation were performed for samples that showed strongyle type eggs in the coproscopic analysis. Subsequently, PCRs to detect pan-nematode DNA and S. vulgaris-specific real-time PCR were performed. Additionally, a real-time PCR with subsequent high-resolution melt curve analysis for species differentiation of Strongylus edentatus, Strongylus equinus and Strongylus asini was established in this project. Strongylus vulgaris-positive samples were analysed in a customized pyrosequencing assay for single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in codons 167, 198 and 200 of the isotype 1 β-tubulin gene, which have been associated with the occurrence of benzimidazole resistance in strongyle nematodes. Serum- and saliva-based ELISAs were performed to detect Anoplocephala spp.-specific antibodies. Furthermore, serum was tested for S. vulgaris-specific antibodies with an ELISA. Strongyle type eggs were found in 66.7% of the faecal samples. Eggs of Oxyuris equi, Anoplocephala spp. and Parascaris spp. were identified in 1.2%, 0.6% and 0.4% of the faecal samples, respectively. DNA of S. vulgaris was detected in the samples of four horses with real-time PCR. These samples did not show SNPs associated with benzimidazole resistance in nematodes by either pyrosequencing or Sanger sequencing. The high-resolution-melt PCR analysis detected DNA of S. edentatus in ten horse samples. Antibodies against Anoplocephala spp. were detected in 16.2% of serum samples, corresponding to a farm prevalence of 52.1%, and in 29.5% of saliva samples, resulting in a farm prevalence of 75.7%. Applying a conservative cut-off value with a sensitivity of 43% and specificity of 96%, a total of 21.2% of the serum samples appeared positive for antibodies against S. vulgaris larvae, corresponding to a farm prevalence of 83.3%. Logistic regression analyses were performed to determine risk factors for positive antibody detection in the serum-based Anoplocephala spp.- and S. vulgaris-ELISA as well as for a positive strongyle faecal egg count (FEC). Limited pasture access was found to be a protective factor in all analyses. Large pastures, pasture rotation and a positive strongyle FEC were identified as risk factors for a positive serum antibody response to Anoplocephala spp., while the simultaneous presence of foals and a high number of horses on the farm as well as the last anthelmintic treatment with praziquantel were protective. A long period of time since the last anthelmintic treatment increased the risk of a positive FEC, whereas the use of moxidectin and ivermectin for the last deworming and an older age of the horse decreased the risk. Age also appeared to be a protective factor for a S. vulgaris-seropositive finding, whereas a selective treatment schedule was classified as a risk factor. Results for the presence of gastrointestinal helminths in horses in this study differed depending on the detection method used, with ELISA results indicating a higher prevalence of Anoplocephala spp. and S. vulgaris than the results from coproscopic methods or PCR. Classification of selective deworming as a risk factor for S. vulgaris antibodies also demonstrates that an evidence-based anthelmintic treatment strategy can benefit from the use of additional detection methods. Therefore, it is recommended to add specific tests for the presence of S. vulgaris or Anoplocephala spp. to parasitological examinations with routine flotation techniques. However, in addition to the monitoring with diagnostic methods and anthelmintic treatment, particularly preventive management practices, such as an adequate pasture management, can help reduce endoparasite burden in horses.