The Role of mDia1/3 Formins and the Actin Cytoskeleton in Synaptic Vesicle Endocytosis

Abstract

Neurotransmission, essential for sensory perception, motor control, cognition, and behavior, occurs at synapses, where neurotransmitters are released from the presynaptic neuron into the synaptic cleft, triggering responses at the postsynaptic cell. At chemical synapses, neurotransmitter release involves the fusion of synaptic vesicles (SVs) with the presynaptic membrane, necessitating compensatory membrane retrieval, termed synaptic vesicle endocytosis, to reform and refill SVs for subsequent fusion cycles. Despite the recognized role of the Actin cytoskeleton in synaptic vesicle endocytosis, the precise mechanisms governing Actin polymerization and its function within presynaptic nerve terminals remain poorly understood. Here, we delineate the pivotal role of Actin regulatory diaphanous-related formins mDia1/3 and small Rho GTPases, RhoA/B and Rac1, in orchestrating synaptic vesicle recycling at rodent central synapses. Employing optical recordings of presynaptic membrane dynamics, ultrastructural and proteomic analyses, in combination with genetic/pharmacological manipulations, we demonstrate that mDia1/3 localize to the presynaptic membrane, proximal to the endocytic machinery, and govern the formation of presynaptic filamentous Actin structures (F-Actin). Loss of F-Actin due to perturbation of mDia1/3 results in significant alterations in presynaptic architecture, impacting plasma membrane homeostasis. Furthermore, our findings highlight that in the absence of mDia1/3, downregulation of RhoA and activation of Rac1 drive a compensatory response to mitigate the disruption of formin-mediated Actin dynamics. Besides modulating Rho GTPase signaling, we find that mDia1/3 negatively regulate the complex signaling network mediated by the mechanistic target of rapamycin complex 2 (mTORC2). We identify mTORC2 activation to be inversely coupled to the kinetics of SV recycling, likely through the modulation of cytoskeletal dynamics. In conclusion, our study elucidates that the endocytic cytoskeleton is governed by interdependent signaling pathways involving the small Rho GTPases RhoA/B and Rac1, as well as the action of mDia1/3 formins, operating within feed forward loops. The dynamics of the Actin cytoskeleton integrate mechanical regulation of synaptic membrane morphology with biochemical signaling mediated by mTORC2 and Rho GTPases to orchestrate the kinetics of synaptic vesicle endocytosis.

Die Neurotransmission spielt eine essenzielle Rolle in der sensorischen Wahrnehmung, der motorischen Kontrolle, der Kognition und dem Verhalten. Sie erfolgt an Synapsen, wo Neurotransmitter von der präsynaptischen Zelle in den synaptischen Spalt freigesetzt werden und eine Reaktion der postsynaptischen Zelle auslösen. An chemischen Synapsen erfolgt die Freisetzung von Neurotransmittern durch die Fusion synaptischer Vesikel mit der präsynaptischen Membran. Diese Fusion erfordert eine kompensatorische Rückreaktion, die als Endozytose bezeichnet wird, um die Rückgewinnung synaptischer Vesikel für erneute Neurotransmission zu gewährleisten. Obwohl eine Rolle des Aktin-Zytoskeletts im Prozess der Endozytose an Synapsen beschrieben wurde, bleiben die genauen Mechanismen, insbesondere die Kontrolle der Aktin-Polymerisation durch Proteine, umstritten. In dieser Arbeit beschreiben wir eine bedeutende Funktion der kleinen Rho-GTPasen RhoA/B und Rac1 und die Diaphanous-verwandten Formine mDia1/3, die das Aktin-Zytoskelett in der Endozytose synaptischer Vesikel in Mauszellen regulieren. Wir nutzen mikroskopische Methoden zur Verfolgung dynamischer Prozesse der Membranfusion und Endozytose sowie zur hochauflösenden Darstellung der Membranstruktur von Synapsen in Kombination mit massenspektrometrischen Analysen und genetischen/pharmakologischen Manipulationen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass mDia1/3 an der präsynaptischen Membran, in der Nähe von der Endozytose-Apparatur, lokalisieren und zur Bildung von filamentösen Aktinstrukturen (F-Aktin) an der Membran beitragen. Die Reduktion von F-Aktin infolge der negativen Manipulation der mDia1/3-Funktionen, führt zu signifikanten Veränderungen der präsynaptischen Membranarchitektur und ihrer Homöostase. Des Weiteren verdeutlichen unsere Resultate, dass in Abwesenheit von mDia1/3 die Aktivität von RhoA herunter - und die Aktivierung von Rac1 hochreguliert wird, als kompensatorische Antwort, um formin-vermittelte Beeinträchtigungen des Zytoskeletts zu mildern. Neben der Modulation von Rho-GTPasen zeigen wir, dass mDia1/3 die komplexen Signalwege, die durch den mechanistischen Target of Rapamycin Komplex 2 (mTORC2) vermittelt werden, negativ regulieren. Wir identifizieren eine inverse Korrelation zwischen der Aktivität von mTORC2 und der Kinetik der Endozytose synaptischer Vesikel in Abhängigkeit vom Aktin-Zytoskelett. Zusammenfassend verdeutlicht unsere Studie, dass das Aktin-Zytoskelett von diversen Signalwegen, die die kleinen Rho-GTPasen RhoA/B und Rac1 sowie die Formine mDia1/3 umfassen, die gegenseitig in Wechselwirkung treten, gesteuert wird. Die Dynamik des Aktin-basierten Zytoskeletts integriert die mechanische Modulation der Morphologie der synaptischen Membran mit biochemischen Signalwegen, die durch mTORC2 und kleine Rho-GTPasen vermittelt werden, um zuverlässig die Endozytose synaptischer Vesikel und damit die Neurotransmission zu regulieren.