The role of FoxP3 in Age-related macular degeneration

Abstract

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine der häufigsten Ursachen für Erblindung bei älteren Menschen in entwickelten Ländern. Sie ist durch den Verlust von Pigmentepithelzellen der Netzhaut (RPE) gekennzeichnet, gefolgt von einer damit verbundenen Degeneration der Photorezeptoren und Choriocapillaris. Das RPE ist ein wesentlicher Bestandteil der äußeren Blut-Netzhaut-Barriere, etabliert das Immunprivileg der Retina und schützt das Auge von entzündlichen Vorgängen. Da bei der AMD wesentliche Hinweise auf ein Versagen der Kontrolle entzündlicher Vorgänge durch das RPE deuten, könnten Entzündungsmediatoren Targets für therapeutische Ansätze sein. Allerdings ist der Entstehungsmechanismus der Erkrankung nicht im Detail verstanden. Das Forkhead-Box-Protein P3 (FoxP3) ist ein charakteristischer Marker regulatorischer T-Zellen, wurde aber in jüngster Zeit auch in RPE-Zellen identifiziert. Unter der Hypothese, dass FoxP3 in RPE-Zellen eine regulatorische Rolle in AMD relevanten Stressbedingungen spielt, haben wir die Funktion des FoxP3 im RPE untersucht. Somit haben wir die Expression, Lokalisation und Phosphorylierung von FoxP3 in murinen Augen und ARPE-19 Zellkulturen unter verschiedenen Stressbedingungen untersucht. Diese Stressbedingungen umfassten den Verlust der epithelialen Integrität, das Alter, die Expostion von IL-1β (als Bestandteil einer Entzündung), autoimmune Uveitis, die Exposition gegenüber Zigarettenrauch und Laser sowie mechanische Verletzungen. Außerdem haben wir die Expression von FoxP3 im RPE menschlicher Augen mit AMD untersucht. Die Expression und Lokalisation von FoxP3 wurden mittels Immunfluoreszenz, Immunhistochemie und PCR sowie durch Dot-Blot-Studien untersucht. Die Zytokin-Sekretion wurde mit Hilfe von Bio-Plex-Beadsanalysen gemessen. Mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie wurde FoxP3 genomisch ausgeknockt, um die FoxP3 Funktion für das RPE unter zellulären Stress zu demonstrieren. Das Ausschalten des FoxP3-Gens führte zum Stillstand des Wachstums der ARPE-19 Zellen, sowie Zelltod in Antwort auf den Zellstress durch die Crsip/Cas9 Behandlung. Die verschiedenen Stressbedingungen, einschließlich dem Verlust der epithelialen Integrität, führten zur erhöhten Expression von FoxP3 als auch zur Translokation in den Zellkern. Konfluente Zellen stellen einen besser differenzierten, stabilen Phänotyp dar, bei dem FoxP3 aus dem Zytosol bei mechanischer Verletzung oder Exposition gegenüber IL-1β im Nukleus akkumulierte. Darüber hinaus förderte der Entzündungsmediator die Phosphorylierung von FoxP3. Diese Ergebnisse deuten im RPE auf eine regulatorische Rolle des FoxP3 im Entzündungsprozess und bei retinaler Degeneration sowie auf eine Bedeutung Stressbedingungen zu widerstehen.

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness among the elderly in the developed world. It is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) cells followed by a subsequent decline in the number of photoreceptors and the choriocapillaris with the possible development of new vessels. In the normal eye, retinal pigment epithelium is an essential component of the outer blood-retina barrier that protects the eye against inflammation. Inflammatory mechanisms during the development of disease in the eye are yet to be fully understood. Forkhead-Box-Protein P3 (FoxP3) was until recently believed to be solely expressed by regulatory T cells but has recently been identified in RPE cells. As the functional role of FoxP3 in the RPE is so far unknown, we investigated its function under the hypothesis that FoxP3 is a general regulator of RPE reactions to different stress conditions. To test our hypothesis, we examined FoxP3 expression, localization, and phosphorylation in murine eyes and ARPE-19 cell-line cultures under different stress conditions. Such stress conditions included sub-confluency, aging, stimulation by IL-1β (as a component of inflammation), autoimmune uveitis, exposure to cigarette smoke and laser, and mechanical injury. In addition, we confirmed FoxP3 expression in the RPE in human eyes with AMD. FoxP3 expression and localization were examined using immunofluorescence, immunohistochemical, and PCR or dot-blot studies. Bio-Plex bead analysis was used to measure the levels of cytokine secretion. Knockout FoxP3 was conducted using CRISPR/Cas9 technology to test the effect of its importance in the development of RPE cells’ stress response. The knockout of the FoxP3 gene resulted in the halting of ARPE-19 cellular growth and/or cell death under the Crisp/Cas9 treatment-induced stress. Under stress conditions, including non-confluency, RPE cells increased the expression of FoxP3 and its translocation into the nucleus. Confluent cells with a more mature and stable phenotype showed FoxP3 localization in the cytosol and upon mechanical injury or exposure to IL-1β translocation into the nucleus. Moreover, inflammation promoted the phosphorylation of FoxP3. Those results imply a regulatory role for FoxP3 in the RPE during chronic inflammation and degeneration and its importance for withstanding stress conditions.