Pain assessment and management in mouse femoral fracture models

Abstract

Preclinical research using animal models is still imperative in biomedical sciences to address the unmet clinical needs in many areas such as fracture healing disorders. General ethical and legal requirements must be carefully considered to provide scientific quality and integrity in animal-based studies. Sufficient reporting, adequate pain assessment and adapted pain management in animal-based research are crucial to generate reliable, reproducible, and comparable data, in line with the humane use of animals in research.

However, ongoing discussions in the scientific community and various systematic literature analyses have indicated that the overall reporting quality in many areas of animal-based biomedical research is still inadequate. Therefore, the first aim of this thesis was to evaluate the status quo of the reporting accuracy of different general and model-specific Parameters and the respective analgesia regimes in studies using adequately stabilized mouse femoral fracture models. High reporting accuracies were identified for the used fixation methods and fracturing procedures as well as the used strain, age, and sex of the mice, while insufficient reporting was found regarding the substrain and genetic background of the mice, body weight, hygiene monitoring, anesthesia, and analgesia. The systematic review also showed marked differences in the route, timepoint and duration of application as well as analgesic dosages, further indicating a need for more evidence-based data on model-adapted pain Management protocols.

The adequate pain assessment and an adapted stress-reduced pain management in laboratory rodents are ongoing challenges, yet essential to improve animal welfare and increase scientific validity and reproducibility. To reduce handling-associated stress while covering the period of greatest pain, the application of analgesics via the drinking water or the injection of sustained-release preparations can be used as an addition or an alternative to repeated injections. However, no sustained-release preparation for pain management in mice is currently available on the European market. The introduction of such a sustained-release buprenorphine would, therefore, be of great benefit for extended pain relief in a variety of different mouse models. Thus, the second part of the thesis focused on the evaluation of the analgesic efficacy of a newly developed depot formulation of buprenorphine (BUP-Depot) for prolonged post-operative pain relief in two mouse osteotomy models. Following a single injection, the analyses of various general and model-specific parameters yielded promising pain-relieving properties of the BUP-Depot for up to 72h post-surgical in female and male mice in both models. The availability of such a sustained-release formulation of buprenorphine would greatly help to further broaden the field of analgesic options in Europe and could have the potential to further refine analgesia in animal-based studies in Europe.

In the third part of the thesis, rearing behavior was evaluated to serve as an additional and meaningful model-specific indicator for pain in the first 72h after femoral osteotomy in mice. The analyzed data indicated significantly reduced rearing behavior after osteotomy, independent of sex or fixation, while anesthesia and analgesia alone did not impact rearing behavior. However, there was no clear evidence that the analysis of rearing behavior could serve as a meaningful sole indicator for residual model-specific skeletal pain in the analyzed models. Thus, further studies are needed to evaluate the value and predictive capacity of rearing behavior to assess pain in skeletal-impaired mouse models.

Overall, this thesis demonstrates that the accuracy of reporting in mouse fracture models needs to be further improved and that guidelines such as the ARRIVE guidelines should be more actively addressed in future studies. Furthermore, the data demonstrated safe use and efficient analgesia of a newly developed sustained-release buprenorphine for 72h after femoral osteotomy and underline the need and relevance of the availability of sustained-release analgesics for refined analgesia in laboratory mice in Europe. Lastly, this thesis indicates an ongoing need for further in-depth analysis and evaluation of easy-to-use and reliable indicators for pain in laboratory mice to ensure animal welfare.

Aktuell bleibt die präklinische Forschung im Tiermodell in den biomedizinischen Wissenschaften nach wie vor unverzichtbar, um den klinischen Bedarf in vielen Bereichen wie zum Beispiel bei Frakturheilungsstörungen zu decken. Um dabei die wissenschaftliche Qualität und Integrität tiergestützter Studien zu gewährleisten, müssen die allgemeinen ethischen und rechtlichen Anforderungen sorgfältig berücksichtigt werden. Ein umfassendes Reporting, eine differenzierte Schmerzbeurteilung und eine angepasste Schmerzbehandlung sind dabei von entscheidender Bedeutung, um verlässliche, reproduzierbare und vergleichbare Daten aus tiergestützten Studien zu generieren.

Anhaltende Diskussionen in der wissenschaftlichen Gemeinschaft und zahlreiche systematische Literaturanalysen haben jedoch gezeigt, dass die Qualität des Reportings in vielen Bereichen der tiergestützten biomedizinischen Forschung noch immer unzureichend ist. Daher wurde in dieser Arbeit zunächst der aktuelle Stand der Reporting-Qualität in Bezug auf verschiedene allgemeine und modellspezifische Parameter sowie die eingesetzten Analgetika-Pläne in Studien mit stabilisierten Maus-Femur-Fraktur-Modellen erfasst. Die Auswertung ergab eine hohe Reporting-Qualität hinsichtlich der eingesetzten Fraktur- und Fixierungsmethoden und sowie in Bezug auf den Stamm, das Alter und das Geschlecht der verwendeten Tiere. Das Reporting der Substämme und des genetischen Hintergrundes, des Körpergewichts, der Hygieneüberwachung, der Anästhesie und Analgesie war hingegen unzureichend. Das systematische Review zeigte außerdem deutliche Unterschiede in Bezug auf den Applikationsweg, -zeitpunkt und die -dauer sowie die Dosierungen der verwendeten Analgetika auf und unterstreicht damit einen weiterhin bestehenden Bedarf an evidenzbasierten Daten für modellspezifische Schmerzbehandlungsprotokolle in der Maus.

Die differenzierte Schmerzbeurteilung und ein angepasstes und stressreduziertes Schmerzmanagement bei Labornagern stellen eine fortwährende Herausforderung dar, sind für die Verbesserung des Tierschutzes und die Erhöhung der wissenschaftlichen Validität und Reproduzierbarkeit jedoch unerlässlich. Methoden wie die Verabreichung von Analgetika über das Trinkwasser oder die Injektion von Depotpräparaten mit verzögerter Wirkstofffreisetzung können genutzt werden, um den Stress durch wiederholte Injektionen zu reduzieren und gleichzeitig den Zeitraum der zu erwartenden Schmerzen abzudecken. Derzeit ist jedoch kein Depotpräparat für die verlängerte postoperative Schmerzlinderung bei Mäusen auf dem europäischen Markt erhältlich und die Einführung eines Buprenorphins mit verzögerter Wirkstofffreisetzung in Europa würde sich daher in einer Vielzahl von Mausmodellen als überaus nützlich erweisen. Daher befasste sich der zweite Teil der Arbeit mit der Bewertung der analgetischen Wirksamkeit eines neu entwickelten Depot-Buprenorphins (BUP-Depot) in zwei Maus-Osteotomie-Modellen. Die umfassende Auswertung unterschiedlicher allgemeiner und modellspezifischer Faktoren ergab, dass das BUP-Depot bei weiblichen und männlichen Mäusen und in beiden Modellen bis zu 72 Stunden post-operativ vielversprechende schmerzlindernde Eigenschaften aufwies. Die Verfügbarkeit eines solchen Buprenorphins mit verzögerter Wirkstofffreisetzung könnte erheblich zur Erweiterung der verfügbaren analgetischen Optionen beitragen und das Potenzial besitzen, die Analgesie in tiergestützten Studien in der Maus in Europa weiter zu verbessern.

Im dritten Teil dieser Arbeit wurde das Rearing-Verhalten (Aufrichten auf die Hinterbeine) als potenziell aussagekräftiger modellspezifischer Indikator für die Schmerzbeurteilung in den ersten 3 Tagen nach Femur-Osteotomie in der Maus untersucht. Die analysierten Daten wiesen auf ein signifikant reduziertes Rearing-Verhalten nach Osteotomie hin, unabhängig von Geschlecht oder Fixierung, während die Anästhesie und Analgesie allein keinen Einfluss auf das Rearing-Verhalten zu haben schienen. Es gab jedoch keine eindeutigen Hinweise darauf, dass die Analyse des Rearing-Verhaltens als alleiniger Indikator für modellspezifische muskuloskelettale Schmerzen in den untersuchten Modellen hilfreich ist. Zukünftig sind daher weitere Studien notwendig, um den Nutzen und die Aussagekraft des Rearing-Verhaltens zur Beurteilung von muskuloskelettalen Schmerzen in Maus-Osteotomie-Modellen konkret zu bewerten und einzuordnen.

Insgesamt zeigt diese Arbeit, dass die Genauigkeit des Reportings in Maus-Fraktur-Modellen weiter verbessert werden muss und dass Leitlinien, wie die ARRIVE-Guidelines, in Zukunft aktiver berücksichtigt und angewendet werden sollten. Darüber hinaus unterstreichet die Arbeit die Notwendigkeit, Relevanz und Vorteile der Verfügbarkeit von Analgetika mit verzögerter Wirkstofffreisetzung für die Anwendung bei Labormäusen in Europa. Die Auswertungen ergaben eine sichere Anwendung und effektive Schmerzlinderungen eines neu entwickelten Buprenorphin Depot Präparates in männlichen und weiblichen Mäusen für 72 Stunden nach Osteotomie. Weiterhin verdeutlicht die Arbeit die bestehende Notwendigkeit für die detaillierte Analyse und Beurteilung von möglichst verlässlichen und anwendungsfreundlichen Indikatoren zur Erkennung von Schmerzen bei der Labormaus, um so den Tierschutz zu gewährleisten.