Manure management measures to reduce the risk of spreading ESBL-/AmpC-producing Escherichia coli from chicken manure into the food chain

Abstract

The prevalence of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)- and AmpC beta-lactamaseproducing Escherichia (E.) coli in the broiler production chain is high. The finding of these resistant bacteria in high numbers in barns and in the environment of broiler farms raises concerns about the use of potentially contaminated chicken manure as fertilizer on fields. As it is assumed that ESBL-/AmpC-producing E. coli can enter the human food chain by contaminated water, vegetables, and fruit after land application of chicken manure, better insights into the survival and the reduction kinetics of these bacteria during storage and chicken manure treatments are needed. Thus, the present work aimed to determine the reduction kinetics of ESBL-/AmpC-producing E. coli during composting and anaerobic digestion with a special focus on potential inactivation factors, above all temperature, carbon/nitrogen (C/N) ratio, and moisture content (MC). To that aim, three studies were carried out.

In the first study, laboratory-scale anaerobic digestion tests were conducted at 37, 42 and 55 °C to investigate the influence of temperature on the reduction kinetics of ESBL-/AmpC-producing E. coli during anaerobic digestion of chicken manure. One ESBL- (CTX-M15) and one plasmid-mediated AmpC- (CMY-2) producing E. coli strain were added to the substrate to achieve an initial bacterial count of 7 log10 colony forming units (cfu) per mL. Both E. coli strains were below the detection limit of <100 cfu/mL after 35 days, with decimal reduction times (Dvalues) of 3-6 days at 37 °C, 1.5 days at 42 °C and 48 min at 55 °C. However, at 37 and 42 °C, ESBL-/AmpC-producing E. coli remained partially detectable by enrichment until the end of the trials after 35 days. Hence, the results showed a strong temperature dependency, whereas no direct correlation could be observed between pH, volatile fatty acids (VFAs) or ammonia (NH3) and E. coli reduction.

The second study aimed to determine the effects of the C/N ratio and MC on the survival of ESBL-producing E. coli during laboratory-scale chicken manure composting in bioreactors. To that aim, a ESBL- (CTX-M15) producing E. coli strain was added to nine compost mixtures with different combinations of MC (20, 40, 60%) and C/N ratios (10:1, 20:1, 40:1) to obtain an initial bacterial count of 7 log10 cfu/g. The fastest decrease in E. coli was observed in all mixtures with a C/N ratio of 10:1 with D-values of 0.27 days to 0.60 days. Additionally, in dry mixtures with an MC of 20% and a C/N ratio of either 10:1 or 40:1, ESBL-producing E. coli were reduced faster than in the moist mixtures despite lower maximum temperatures within the bioreactors. The highest D-value of 4.82 days was determined for a mixture with a C/N ratio of 40:1 and 40% MC. While temperature was the main inactivation factor, in dry mixtures, desiccation also played a significant role. Significant effects of the C/N ratio and MC on the number of ESBL-producing E. coli as well as on temperature development were shown. In addition, it was demonstrated that even suboptimal composting mixtures – typical for chicken manure – led to a rapid reduction in ESBL-producing E. coli.

To validate the results of the laboratory composting trials in a more practical environment, in a third study, pilot-scale composting of chicken manure was performed at the test grounds in Potsdam. Here, the influences of three different management treatments for chicken manure, composting in (i) static piles, (ii) static piles covered with a compost fleece, and (iii) periodically turned piles, were determined with respect to the survival of an artificially added, nonresistant E. coli strain (DSM 1116) during different environmental conditions (summer and winter). The results showed an even faster reduction in E. coli and higher temperatures within the compost mass than in the laboratory-scale composting trials. Within 24 hours, E. coli were no longer detectable by direct count in any piles in either center or subsurface locations. By day 28, E. coli were also no longer qualitatively detectable in any samples. Within these 24 hours, temperatures exceeded 50 °C in all piles, which was most likely responsible for the fast inactivation of E. coli. The statistical analysis revealed the significant influences of sample location (center, subsurface) and the total hours at temperatures ≥ 50 °C and ≥ 55 °C in the piles on the survival of E. coli in the chicken manure compost. Although no influences of season or manure treatment method were shown, periodical turning is recommended, especially in winter, to increase the likelihood of exposure of all parts of the compost, including possible ESBL-/AmpC-producing E. coli, to high temperatures.

Taken together, the results of the three studies showed the effectiveness of both composting and anaerobic digestion in terms of ESBL-/AmpC-producing E. coli reduction. The reasons for the reduction in ESBL-/AmpC-producing-E. coli were multifactorial, with temperature being the main inactivation factor. Most likely due to the chicken manure characteristics of a low MC and a low C/N ratio, even in stored, nonmanaged or only minimally managed chicken manure, ESBL-producing-E. coli levels were reduced below the detection limit after one day. Therefore, concluding the results of this work, the risk of spreading ESBL-/AmpC-producing E. coli to land by using chicken manure, chicken manure compost, or digestate from biogas plants running on chicken manure is considered low. Composting of chicken manure with periodic turning or anaerobic digestion at thermophilic temperatures are the safest methods in terms of ESBL-/AmpC-producing E. coli reduction to treat chicken manure before application to land and are therefore highly recommended.

Die Prävalenz Extended-Spektrum Beta-Laktamase (ESBL) und AmpC-Beta-Laktamase bildender Escherichia (E.) coli in der Masthähnchenproduktionskette ist hoch. Das Vorkommen dieser resistenten Bakterien in hohen Konzentrationen in Ställen und der Umgebung von Masthähnchenbetrieben gibt Anlass zur Sorge vor der Verwendung von möglicherweise kontaminiertem Hähnchenmist als Dünger auf Feldern. Da angenommen wird, dass ESBL-/AmpC-bildende E. coli nach dem Ausbringen von Hähnchenmist auf Feldern über kontaminiertes Wasser, Gemüse und Obst in die menschliche Nahrungskette gelangen können, ist es erforderlich, einen besseren Einblick in das Überleben und die Reduktionskinetik dieser Bakterien während der Lagerung und der Behandlung von Hähnchenmist zu gewinnen. Die vorliegende Arbeit hatte daher zum Ziel, die Reduktionskinetik von ESBL-/AmpC-bildenden E. coli während der Kompostierung und der anaeroben Vergärung zu bestimmen. Dabei lag ein besonderer Fokus auf möglichen Inaktivierungsfaktoren, allen voran der Temperatur, dem Kohlenstoff/Stickstoff (C/N)-Verhältnis und dem Feuchtigkeitsgehalt (MC). Zu diesem Zweck wurden drei Studien durchgeführt.

In der ersten Studie wurden anaerobe Vergärungstests im Labormaßstab bei 37, 42 und 55 °C durchgeführt, um den Einfluss der Temperatur auf die Reduktionskinetik ESBL-/AmpC-bildender E. coli während der anaeroben Vergärung von Hähnchenmist zu untersuchen. Dabei wurden dem Substrat ein ESBL- (CTX-M15) und ein Plasmid-vermittelter AmpC- (CMY-2) bildender E. coli-Stamm zugegeben, um eine anfängliche Bakterienzahl von 7 log10 koloniebildenden Einheiten (KbE) pro mL zu erhalten. Beide E. coli-Stämme lagen nach 35 Tagen unter der Nachweisgrenze von <100 KbE/mL mit dezimalen Reduktionszeiten (D-Werten) von 3-6 Tagen bei 37 °C, 1,5 Tagen bei 42 °C und 48 min bei 55 °C. Bei 37 und 42 °C blieben ESBL-/AmpC-bildende E. coli jedoch teilweise bis zum Ende der Versuche nach 35 Tagen qualitativ nachweisbar. Die Ergebnisse zeigten daher eine starke Temperaturabhängigkeit, während keine direkte Korrelation zwischen pH, flüchtigen Fettsäuren (VFAs) oder Ammoniak (NH3) und einer E. coli-Reduktion beobachtet werden konnte.

Die zweite Studie zielte darauf ab, die Auswirkungen des C/N-Verhältnisses und des MCs auf das Überleben ESBL-bildender E. coli während der Kompostierung von Hähnchenmist in Bioreaktoren im Labormaßstab zu bestimmen. Zu diesem Zweck wurde ein ESBL- (CTX-M15) bildender E. coli-Stamm zu neun Kompostmischungen mit unterschiedlichen Kombinationen aus MC (20, 40, 60 %) und C/N-Verhältnis (10:1, 20:1, 40:1) gegeben, um eine anfängliche Bakterienzahl von 7 log10 KbE/g zu erhalten. Die schnellste Abnahme von E. coli wurde in allen Mischungen mit einem C/N-Verhältnis von 10:1 mit D-Werten von 0,27 Tagen bis 0,60 Tagen beobachtet. Zusätzlich wurden in trockenen Mischungen mit einem MC von 20 % und einem C/N-Verhältnis von entweder 10:1 oder 40:1 ESBL-bildende E. coli schneller reduziert als in den feuchteren Mischungen, trotz niedrigerer Maximaltemperaturen innerhalb der Bioreaktoren. Der höchste D-Wert von 4,82 Tagen wurde für eine Mischung mit einem C/N-Verhältnis von 40:1 und 40 % MC bestimmt. Während die Temperatur der Hauptinaktivierungsfaktor war, spielte bei den trockenen Mischungen auch die Austrocknung eine bedeutende Rolle. Es konnte ein signifikanter Einfluss von C/N-Verhältnis und MC auf die Anzahl ESBL-bildender E. coli sowie auf die Temperaturentwicklung gezeigt werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass selbst suboptimale Kompostmischungen – typisch für Hähnchenmist – zu einer schnellen Reduktion von ESBL-bildenden E. coli führten.

Um die Ergebnisse der Kompostierungsversuche im Labormaßstab in einem praxisnäheren Umfeld zu validieren, wurde in einer dritten Studie auf dem Versuchsgelände in Potsdam eine Kompostierung von Hähnchenmist im Pilotmaßstab durchgeführt. Hier wurde der Einfluss von drei verschiedenen Behandlungsverfahren für Hähnchenmist: Kompostierung in (i) statischen Mieten, (ii) mit einem Kompostvlies bedeckten statischen Mieten und (iii) regelmäßig umgesetzten Mieten während verschiedener Umweltbedingungen (Sommer und Winter) auf das Überleben eines künstlich zugesetzten, nicht resistenten E. coli-Stammes (DSM 1116) bestimmt. Die Ergebnisse zeigten eine noch schnellere Reduktion von E. coli und höhere Temperaturen innerhalb der Kompostmasse als bei den Kompostierungsversuchen im Labormaßstab. Innerhalb von 24 Stunden waren E. coli quantitativ in keiner Miete, weder im Zentrum noch unterhalb der Oberfläche, mehr nachweisbar. An Tag 28 waren E. coli auch qualitativ in keinen Proben mehr nachweisbar. Innerhalb dieser 24 Stunden überstiegen die Temperaturen in allen Mieten 50°C und waren höchstwahrscheinlich verantwortlich für die schnelle Inaktivierung von E. coli. Die statistische Analyse zeigte einen signifikanten Einfluss des Probenortes (Mitte, unter der Oberfläche) und der Gesamtstunden bei Temperaturen ≥ 50 °C und ≥ 55 °C in den Mieten auf das Überleben von E. coli im Hähnchenmist-Kompost. Obwohl kein Einfluss der Jahreszeit und der Behandlungsmethode gezeigt werden konnte, wird ein regelmäßiges Umsetzen, insbesondere im Winter, empfohlen, um die Wahrscheinlichkeit einer Exposition aller Teile des Komposts, einschließlich möglicher ESBL-/AmpC-bildender E. coli, mit hohen Temperaturen zu erhöhen.

Zusammengenommen zeigten die Ergebnisse der drei Studien die Wirksamkeit von sowohl Kompostierung als auch anaerober Vergärung in Bezug auf die Reduktion ESBL-/AmpC-bildender E. coli. Dabei waren die Gründe für die Reduktion von ESBL-/AmpC-bildenden E. coli multifaktoriell, wobei die Temperatur der Hauptinaktivierungsfaktor war. Höchstwahrscheinlich wurden ESBL-bildende E. coli aufgrund der Eigenschaften von Hähnchenmist mit seinem niedrigen MC und C/N-Verhältnis selbst in gelagertem, nicht behandeltem oder nur minimal behandeltem Hähnchenmist bereits nach einem Tag unter die Nachweisgrenze reduziert. Aus diesem Grund wird als Schlussfolgerung aus den Ergebnisse dieser Arbeit das Risiko einer Verbreitung ESBL-/AmpC-bildender E. coli in der Umwelt durch die Verwendung von Hähnchenmist, Hähnchenmistkompost oder Gärresten aus Biogasanlagen, die mit Hähnchenmist betrieben werden, als gering eingeschätzt. Die Kompostierung von Hähnchenmist mit regelmäßigem Umsetzen oder die anaerobe Vergärung bei thermophilen Temperaturen sind die sichersten Methoden zur Düngebehandlung vor Ausbringung in Hinblick auf die Reduktion von ESBL-/AmpC-bildenden E. coli und werden daher dringend empfohlen.