The role of Innate Lymphoid Cells Type 3 during lactation-induced gut hyperplasia

Abstract

During lactation, the gut mucosa undergoes expansion to accommodate increased food consumption and absorption, in order to meet the increased energy demands associated with nurturing neonates. Previous studies have investigated the impact of litter size, hormones, and diet on lactation-induced gut hyperplasia, yet the role of immune cells remained unexplored. The recently discovered innate lymphocytes type 3 (ILC3s) have emerged as key players not only in organizing lymphoid tissues but also in protecting the intestinal epithelium against tissue damage and genotoxic stress. Thus, we explored the contribution of ILC3s to lactation-induced gut hyperplasia. Our immunofluorescence analysis revealed that mice lacking RORγt, the transcription factor crucial for ILC3 development and function, exhibited shorter villi and reduced proliferation in the crypts, where the intestinal stem cells reside. Subsequent analysis using IL-22-deficient mice, a cytokine primarily expressed by ILC3s, suggests that ILC3s promote lactation-induced gut hyperplasia in an IL-22-dependent manner. Furthermore, our findings demonstrated that STAT3 in the intestinal epithelium, known to be stimulated by IL-22 and EGF, also contributes to increased proliferation and villus growth in lactating mice.

Flow cytometry experiments and histological analyses confirmed increased ILC3 proliferation during lactation and enlargement of the clusters ILC3s form proximal to the crypts, namely cryptopatches and isolated lymphoid follicles. Bulk RNA sequencing and leukocyte stimulation experiments between non-pregnant (NP) and lactating mice, confirmed the upregulation of IL-22 in ILC3s during lactation, a finding further validated through the analysis of IL-22 tdTomato reporter mice. Single-cell RNA sequencing of intestinal epithelial cells from both ILC3-sufficient and deficient mice unveiled downregulation of the EGF signaling in the gut, which was validated by quantification of EGFR phosphorylation in epithelial cells. The phosphorylation of EGFR, linked to ligand binding, was confirmed to be associated with EGF upregulation during lactation, originating from mesenchymal PDPN+ cells. Notably, RORγt-dependent cells were found to regulate EGF production in mesenchymal cells in an IL-22-dependent manner upon lactation.

Moreover, our study demonstrated that IL-22 modulates genes associated with nutrient absorption in gut epithelium in vitro, differentially to the IL-20 and IL-24 cytokines, which also bind to the IL-10RB receptor. Lastly, we observed that lactating RORγt and IL22-deficient mice consumed more food than the WT control mice, presumably to compensate for reduced food absorption. However, due to their reduced absorptive epithelial surface, the body weight of IL-22-sufficient offspring nurtured from ILC3- and IL-22-deficient mice was reduced.

Während der Laktation dehnt sich die Darmschleimhaut aus, um eine erhöhte Nahrungsaufnahme zu ermöglichen, um den erhöhten Energiebedarf zu decken, der mit der Aufzucht von Neugeborenen verbunden ist. In früheren Studien wurden die Auswirkungen der Wurfgröße, der Hormone und der Ernährung auf die laktationsbedingte Darmhyperplasie untersucht, doch die Rolle der Immunzellen blieb unerforscht. Die kürzlich entdeckten angeborenen Lymphozyten vom Typ 3 (ILC3) haben sich als Schlüsselfaktoren nicht nur bei der Organisation des lymphatischen Gewebes, sondern auch beim Schutz des Darmepithels vor Gewebeschäden und genotoxischem Stress erwiesen. Daher haben wir ihren Beitrag zur laktationsinduzierten Darmhyperplasie untersucht. Unsere Immunfluoreszenzanalyse ergab, dass Mäuse, denen der für die Entwicklung und Funktion der ILC3 entscheidende Transkriptionsfaktor RORγt fehlte, kürzere Zotten und eine geringere Proliferation in den Krypten aufwiesen, wo sich die Darmstammzellen befinden. Eine anschließende Analyse mit IL-22-defizienten Mäusen, einem Zytokin, das in erster Linie von ILC3 exprimiert wird, deutet darauf hin, dass ILC3 die laktationsinduzierte Darmhyperplasie auf eine IL-22-abhängige Weise fördern. Darüber hinaus haben unsere Ergebnisse gezeigt, dass STAT3 im Darmepithel, von dem bekannt ist, dass es durch IL-22 und EGF stimuliert wird, ebenfalls zur verstärkten Proliferation und zum Zottenwachstum bei laktierenden Mäusen beiträgt.

Durchflusszytometrie-Experimente und histologische Analysen bestätigten eine erhöhte ILC3-Proliferation während der Laktation und eine Vergrößerung der Cluster, die ILC3 in der Nähe der Krypten bilden, nämlich Kryptopatches und isolierte lymphoide Follikel. Experimente zur RNA-Sequenzierung und Leukozytenstimulation zwischen nicht trächtigen und laktierenden Mäusen bestätigten die Hochregulierung von IL-22 in ILC3s während der Laktation, ein Ergebnis, das durch die Analyse von IL-22tdTomato-Reportermäusen bestätigt wurde. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung von Darmepithelzellen sowohl von ILC3-ausreichenden als auch von ILC3-defizienten Mäusen enthüllte eine Herunterregulierung des EGF-Signalwegs im Darm, was durch die Quantifizierung der EGFR-Phosphorylierung in Epithelzellen bestätigt wurde. Es wurde bestätigt, dass die mit der Ligandenbindung verbundene Phosphorylierung des EGFR mit der EGF-Hochregulierung während der Laktation verbunden ist, die von mesenchymalen PDPN+-Zellen ausgeht. Insbesondere wurde festgestellt, dass RORγt-abhängige Zellen die EGF-Produktion in mesenchymalen Zellen in einer IL-22-abhängigen Weise während der Laktation regulieren.

Darüber hinaus zeigte unsere Studie, dass IL-22 Gene moduliert, die mit der Nährstoffaufnahme im Darmepithel in vitro in Verbindung stehen, und zwar im Unterschied zu den Zytokinen IL-20 und IL-24, die ebenfalls an den IL-10RB-Rezeptor binden. Schließlich beobachteten wir, dass laktierende RORγt- und IL22-defiziente Mäuse mehr Nahrung zu sich nahmen als die WT-Kontrollgruppe, vermutlich um die verminderte Nahrungsaufnahme zu kompensieren. Aufgrund ihrer reduzierten absorbierenden Epitheloberfläche war jedoch das Körpergewicht der IL-22-ausreichenden Nachkommen, die von ILC3- und IL-22-defizienten Mäusen aufgezogen wurden, reduziert.