Trends in Artemether-Lumefantrine resistance of Plasmodium falciparum in Southern Rwanda

Abstract

Since the implementation of artemisinin combination therapy, malaria morbidity, and mortality has drastically declined globally. However, artemisinin partial resistance has emerged in Southeast Asia, impeding effective malaria control. In Africa, where most malaria cases and deaths occur, dissemination of such resistance will have disastrous consequences. Genetic markers in the malaria parasite Plasmodium falciparum are an essential tool to assess the status of resistance. Mutations in the Kelch-13 (pfk13) gene are associated with artemisinin partial resistance. Certain allele combinations in the multi- drug resistance-1 (pfmdr1) gene associate with altered dihydro-artemisinin (DHA) and lumefantrine susceptibility. In vitro ring-stage survival assays uncover prolonged parasite clearance after DHA treatment.

We assessed the prevalence of pfk13 mutations in 2019 and pfmdr1 in 2018/2019 in southern Rwanda, where artemether-lumefantrine (AL) is the first-line treatment for uncomplicated malaria since 2006. Isolates with relevant pfk13 mutations were subjected to ring-stage survival assays (RSA) and IC50 measurements. We recruited 205 patients in 2018 and 90 patients in 2019 with positive rapid tests and symptoms of uncomplicated malaria in two health centers in the Huye District. Among the PCR-confirmed cases, 90.3% (167/183 [2018] and 67/76 [2019]) had a P. falciparum infection. In 2019, 12.1% of the P. falciparum isolates harbored non-synonymous pfk13 mutations. Mutations R561H (3/66; 4.5%, validated resistance marker), C469F, A675V (candidate markers), and G533A, V555A and A578S were present. Compared to data from 2010, 2014, and 2015 from the same region, the prevalence of non-synonymous pfk13 mutations increased significantly (OR 1.4, 95% CI 1.1, 1.8; P = 0.003). RSAs showed elevated mean survival rates above the WHO resistance threshold of 1%: for R561H (4.7% ± 1.5%), A675V (1.4% ± 0.2%), and C469F (9.0% ± 1.6%). Correspondingly, IC50 values were 14.1 ± 4.0 nmol/l for R561H, 7.4 ± 3.3 nmol/l for A675V, and 6.9 ± 1.5 nmol/l for C469F. In 2018/2019, pfmdr1 mutations N86Y, Y184F, and D1246F were present in 3.8%, 53.8%, and 2.4%, respectively. Compared to data from 2010, N86Y occurred ten and D1246F five times less frequently, whereas the Y184F prevalence remained similar. NYD and NFD allele combinations were dominant, and genetic diversity had declined since 2010.

In conclusion, pfk13 mutations conferring resistance to artemisinin combined with pfmdr1 allele combinations that associate with decreased lumefantrine susceptibility are present in Rwanda. While no treatment failure has been observed, AL is in danger of becoming less effective. The introduction of triple artemisinin combination therapies might be a first step to preserving the efficacy of these antimalarials.

Seit der Einführung der Artemisinin-Kombinationstherapie sind Morbidität und Mortalität der Malaria weltweit stark zurückgegangen. In Südostasien erschwert jedoch eine partielle Artemisinin-Resistenz eine wirksame Malariakontrolle. In Afrika, wo die meisten Erkrankungen und Todesfälle auftreten, wird die Verbreitung einer solchen Resistenz katastrophale Folgen haben. Genetische Marker beim Malariaparasiten Plasmodium falciparum sind ein wichtiges Instrument zur Einschätzung der Resistenz-Situation. Mutationen im Kelch-13 (pfk13)-Gen gehen mit einer partiellen Artemisinin-Resistenz einher. Bestimmte Allel-Kombinationen im Multi-Drug-Resistance-1 (pfmdr1)-Gen sind mit einer veränderten Wirksamkeit von Dihydro-Artemisinin (DHA) und Lumefantrin assoziiert. In vitro Ringstage Survival Assays (RSA) weisen eine verzögerte Parasitenbeseitigung nach DHA-Behandlung nach.

Wir untersuchten die Prävalenz von pfk13 Mutationen im Jahr 2019 und von pfmdr1 in 2018/2019 in Süd-Ruanda, wo Artemether-Lumefantrin (AL) seit 2006 die Erstlinientherapie für unkomplizierte Malaria ist. Isolate mit relevanten pfk13 Mutationen wurden einem RSA und IC50-Messungen unterzogen. In zwei Gesundheitszentren im Distrikt Huye rekrutierten wir 205 Patienten im Jahr 2018 und 90 Patienten im Jahr 2019 mit positivem Schnelltest und Symptomen unkomplizierter Malaria. Bei 90,3 % (167/183 [2018] und 67/76 [2019]) der PCR bestätigten Fällen stellten wir eine P. falciparum-Infektion fest. 2019 wiesen 12,1 % der P. falciparum-Isolate nichtsynonyme pfk13 Mutationen auf. Der validierte Resistenzmarker R561H (3/66, 4,5 %), die Kandidatmarker C469F und A675V, und G533A, V555A und A578S wurden nachgewiesen. Im Vergleich zu den Jahren 2010, 2014 und 2015 aus derselben Region stieg die Prävalenz nichtsynonymer pfk13 Mutationen signifikant an (OR 1,4, 95 % CI 1,1, 1,8; P = 0,003). Die RSA zeigten erhöhte mittlere Überlebensraten oberhalb der WHO-Resistenzschwelle von 1 %: 4,7 % ± 1,5 % für R561H, 1,4 % ± 0,2 % für A675V und 9,0 % ± 1,6 % für C469F. Dementsprechend lagen die IC50-Werte bei 14,1 ± 4,0 nmol/l für R561H, 7,4 ± 3,3 nmol/l für A675V und 6,9 ± 1,5 nmol/l für C469F. In den Jahren 2018/2019 waren die Pfmdr1-Mutationen N86Y in 3,8 %, Y184F in 53,8 % und D1246F in 2,4 % der Isolate vorhanden. Verglichen zu Daten aus 2010 ging die Prävalenz von N86Y um das Zehnfache und von D1246F um das Fünffache zurück, während die Y184F-Prävalenz ähnlich blieb. Die Allelkombinationen NYD/NFD waren dominant, und die genetische Vielfalt von pfmdr1 nahm seit 2010 ab.

Zusammenfassend zeigt diese Studie in Ruanda das Aufkommen von pfk13 Mutationen, die Resistenz gegen Artemisinin verleihen und von pfmdr1 Allelkombinationen, die mit einer verminderten Lumefantrin-Empfindlichkeit einhergehen. Obwohl bisher kein Therapieversagen beobachtet wurde, ist die Wirksamkeit von AL gefährdet. Die Einführung von Dreifach-Artemisinin-Kombinationstherapien könnte ein erster Schritt zur Erhaltung der Wirksamkeit sein.