Analysis of the glutamine dependent transaminases as possible therapeutic targets in colon cancer cells

Abstract

The project’s objective is to gain knowledge about the interconnection between cell growth and metabolism in the colon cancer cells HCT116 and RKO that rely on glutamine’s nitrogen. The non-cancerous HEK293 cells were tested in parallel to understand the specific metabolic settings and differences in glutamine-independent proliferation. A proteome analysis via liquid chromatography coupled to mass spectrometry (MS) was performed and revealed compartment specific protein expression in HCT116 and RKO cells. Interestingly, the enzyme glutamine synthetase (GLUL) was highly expressed in HEK293 cells under normal growth conditions. We wanted to know if HCT116 and RKO cells can grow independently from glutamine and starved the cells upon glutamine for a longer period. Surprisingly, HCT116 cells survived and persisted, while RKO cells did not. We suspected small molecules or residual glutamine in the growth medium and replaced the cell culture medium composition by dialyzed fetal bovine serum (FBS). Interestingly, in this case neither HCT116 nor HEK293 cells were able to proliferate when glutamine was deprived. Thus, glutamine was also essential for these cells when using dialyzed FBS. Based on these results, we assumed that HCT116 and HEK293 cells synthesize glutamine in the absence of external glutamine. Therefore, a supplementation growth experiment with substrates of the glutamine-centric metabolic network was performed. HCT116 and HEK293 cells showed highest proliferation rates in Glu + NH4 +, while RKO cells revealed an irreplaceable dependence on glutamine supplemented medium. Treatment with a competitive inhibitor of glutamine synthetase, methionine sulfoximine (MSO), blocked proliferation. Thus, glutamine synthetase was confirmed to be the survival factor in glutamine-depleted conditions, if substrates are provided. In order to examine the metabolic fate of glutamine, newly synthesized via GLUL, we have developed an isotope tracing technique using ultra high resolution MS, which allows us to distinguish between simultaneous labeling of carbon- 13 and nitrogen-15 isotopic patterns and that allows new insights into biological reactions in glutamine-deprived HCT116, RKO and HEK293 cells. With this new technique we were able to observe 13C and 15N incorporation in purine nucleotides. Additionally, we investigated the glutamine-analogue 6-Diazo-5-oxo-l-norleucine (DON) as it inhibits all glutamine-utilizing enzymes with focus on amidotransferases. An inital DON-inhibition experiment was performed to examine the interconnection of nucleotide synthesis and glutamine. We revealed an accumulation of nucleotide intermediates in HCT116 and HEK293 cells. To gain a clearer understanding, we traced glutamine‘s nitrogen flow in de novo nucleotide biosynthesis and where it is interfered by DON. Therefore, in the Kempa laboratory a new technique and method based on direct-infusion MS was developed that facilitates dynamic tracing of nitrogen with applied drugs on nucleotide substrates (Rayman (2022)). Finally, we observed decreased nitrogen incorporation into FGAR and the nucleotides of the purine pathway upon DON treatment in HCT116 cells. In conclusion, we demonstrated the inability of RKO cells to synthesize glutamine or to compensate glutamine-deficiency perhaps because of missing functionality of the enzyme GLUL. However, HCT116 and HEK293 cells have proven survivability. Furthermore, we were able to show DON targets in the purine nucleotide biosynthesis.

Ziel des Projekts ist es, Kenntnisse über die Verbindungen zwischen Zellwachstum und Metabolismus in Kolonkrebszellen zu erlangen, die vom Nitrogen des Glutamins abhängig sind. Die nicht-karzenomen HEK293-Zellen waren Gegenstand von Parallelversuchen, deren Zielsetzung das Verständnis von spezifischen metabolischen Grundanlagen und Unterschieden bei Glutamin-unabhängiger Proliferation waren. Eine Proteomen-Analyse via Flüssigchromatographie verbunden mit Massenspektrometrie offenbarte Kompartiment spezifische Protein-Expressionen in HCT116- und RKO-Zellen. Bemerkenswerterweise war die Glutamin-Synthetase (GLUL) in HEK293-Zellen bereits unter normalen Bedingungen hochgradig exprimiert. Wir wollten nun wissen, ob HCT116- und RKO-Zellen von Glutamin unabhängig wachsen können, und enthielten ihnen zunächst für eine längere Zeit Glutamin gänzlich vor. Überraschenderweise überlebten die HCT116-Zellen und blieben bestehen, während dies den RKO-Zellen nicht gelang. Wir führten dies auf kleine Moleküle oder restliches Glutamin imWachstumsmedium zurück und ersetzten die Zellkulturmediumskomposition durch dialysiertes Rinderfötalserum (FBS). Interessanterweise gelang es in diesem Falle weder den HCT116- noch den HEK293-Zellen, sich unter Glutamin-Abwesenheit zu vermehren. Damit erwies sich Glutamin also auch für HEK293-Zellen bei Nutzung dialysierten FBS’ als essentiell. Basierend auf diesen Ergebnissen kamen wir zu dem Schluss, dass HEK293-Zellen in Abwesenheit externen Glutamins das fehlende Glutamin selbst synthetisieren. Deshalb wurde ein Supplementierungs- Wachstumsexperiment mit Substraten aus dem Glutamin zentrischen metabolischen Netzwerk durchgeführt. HCT116- und HEK293-Zellen zeigten die höchsten Vermehrungsraten in Glu + NH4 +, während RKO-Zellen eine unersetzbare Abhängigkeit von Glutamin supplementiertem Medium zeigten. Die Behandlung mit einem konkurrierenden Inhibitor der Glutamin- Synthetase, Methionin-Sulfoximin (MSO), blockierte die Vermehrung, wodurch sich die Glutamin- Synthetase als der entscheidende Überlebensfaktor unter Glutamin entzogenen Bedingungen erwies, wenn Substrate zur Verfügung gestellt werden. Um das metabolische Schicksal des via GLUL neu synthetisierten Glutamins zu untersuchen, haben wir eine Isotopen- Tracing-Technik auf dem ultrahoch auflösenden Massenspektrometer entwickelt, die uns ermöglicht, isotopische Muster der simultan gelabelten 13C und 15N voneinander zu unterscheiden, was neue Einblicke in biologische Reaktionen in des Glutamins beraubten HCT116-, RKOund HEK293-Zellen ermöglicht. Wir beobachteten Carbon-13- und Nitrogen-15-Inkorporation bei Purin-Nucleotiden. Darüberhinaus untersuchten wir das Glutamin-Analog DON, da es alle Glutamin verwendenden Enzyme inhibiert, wobei wir den Schwerpunkt auf die Amidotransferasen legten. Ein einleitendes DON-Inhibitionsexperiment wurde durchgeführt, um die Zusammenschaltung von Nucleotid-Synthese und Glutamin zu untersuchen. Dies legte die Akkumulation von Nucleotid-Intermediaten in HCT116- und HEK293-Zellen offen. Um dies besser zu verstehen, verfolgten wir den Nitrogen-Fluss des Glutamin in der de novo Nucleotid- Biosynthese und wo dieser von DON gestört wird. Hierfür wurde in der Kempa-Gruppe eine neue Technik und Methode entwickelt, basierend auf der Direktinfusion MS, die eine dynamische Untersuchung des Nitrogens mittels Drogen hinsichtlich der Nucleotid-Substrate ermöglicht (Rayman (2022)). Schließlich beobachteten wir abnehmende Nitrogen-Einbindung in FGAR und in die Nucleotide des Purin-Weges bei DON-Behandlung in HCT116-Zellen. Abschließend demonstrierten wir die Unfähigkeit der RKO-Zellen, Glutamin zu synthetisieren oder Glutamin-Defizienz durch andere Substrate zu kompensieren, was womöglich auf die fehlende Funktionalität des Enzyms GLUL zurückzuführen ist. Demgegenüber erwiesen sich HCT116- und HEK293-Zellen als überlebensfähig. Des Weiteren konnten wir DON-Targets in der Purine Nukleotidbiosynthese zeigen.