Lysosomal storage diseases (LSDs) are a group of rare, inherited metabolic disorders, whereby the deficiency of a single lysosomal enzyme leads to accumulation of metabolites in the lysosome cells. This in turn results in cellular dysfunction and clinical abnormalities such as enlarged organs, connective-tissue, ocular pathology and central nervous system dysfunction. To date, there is no cure for LSDs; enzyme replacement therapy (ERT) however can be used to treat several of these disorders. In such case, a recombinant enzyme is administered intravenously to patients and routed to the deficient cells via receptor mediated transport ways. Although ERT has proven to be successful in slowing down lysosomal storage and improving patient’s quality of life, there are still a number of unmet needs. This includes A) the difficulties encountered during the production of the acid hydrolases, in particular the synthesis of mannose-6-phosphate (M6P), B) the loss of intravenously administered enzyme to the liver asialoglycoprotein receptor (ASGPR), C) the inability of ERT to cross the blood brain barrier. In an effort to address these numerous issues, an attempt was made to develop “tools” for the production of improved recombinant lysosomal enzymes. The initial focus was set upon modifying Glycotope’s host cell line in order to increase M6P levels of the recombinant enzymes and thereby enhancing target- cell delivery. The resulting cell lines enabled production of recombinant α-Galactosidase A (GAL) enzymes exposing relative M6P levels close to 80 %, compared to the initial 40 % of the control enzyme. This increased M6P level in turn led to a 4-fold increase in receptor-mediated cellular uptake when tested in vitro. The second objective was the modification of the recombinant enzyme GAL itself. Emphasis was set upon addressing ASGPR-mediated product loss to the liver. A fusion enzyme was thereby generated exhibiting an up to 20-fold reduced affinity for the liver ASGPR when assessed in vitro. Furthermore, in vivo data generated during a mouse pharmacokinetic study, revealed that the liver uptake of the intravenously administered fusion enzyme was reduced by around 30 % compared to the reference enzyme. In addition, a 1.5-fold increase in kidney uptake was observed for the fusion enzyme. Finally, the transport of recombinant enzymes to the brain was investigated. To this end, several fusion enzyme formats were generated based on the so- called molecular Trojan-horse technique, whereby molecules are engineered to bind to transcytosis-triggering receptors (i.e. transferrin receptor (TFR)). Recombinant fusion products were successfully generated, purified and characterized in vitro, with at least one enzyme revealing bi-functionality. Indeed, the fusion product showed catalytic activity on one hand and TFR binding ability on the other, thus possibly enabling transcytosis across the BBB.
Lysosomale Speicherkrankheiten (LSK) bilden eine Gruppe von seltenen genetisch bedingten und vererbbaren Stoffwechselerkrankungen. Allen Erkrankungen ist gemeinsam, dass ein lysosomales Enzym in der Funktionalität eingeschränkt ist oder komplett fehlt. Stoffwechselprodukte reichern sich zunächst in den Lysosomen verschiedener Zellen an und gelangen ab einer bestimmten Konzentration in den extrazellulären Raum. Dies führt zu gesundheitlichen Störungen und Symptomen, die mit Veränderungen des Zellstoffwechsels verbunden sind und im weiteren Verlauf zum Zelltod führen. Je nach Art der Erkrankung kommt es zu Schädigungen des Nervensystems, der Knochen, Muskeln, Nieren und Milz, des Herzens und weiterer Organe. Seit ca. 10 Jahren stehen Enzymersatztherapien (ERT) zur Verfügung. Hierbei wird das betroffene Enzym mittels rekombinanter Proteintechnik hergestellt und dem Patienten durch regelmäßige Infusionen verabreicht. Obwohl die derzeit eingesetzte ERT in der Lage ist, einen Teil der fehlende Enzymaktivität in verschiedenen Zellen auszugleichen, hat sich gezeigt, dass die Herausforderung darin besteht, alle betroffenen Zellen bzw. Gewebe spezifisch und effizient zu erreichen. Des Weiteren stellt auch die Herstellung der rekombinanten Enzyme oft eine Herausforderung dar, insbesondere die schwer steuerbare Synthese von Mannose-6-Phosphat (M6P). Letztens liegt die größte Herausforderung darin, dass viele der LSK neurologische Störungen verursachen, die bis heute nicht durch ERT behandelt werden können. Der Grund dafür ist die Blut-Hirn-Schranke (BHS), deren Überwindung für größere Moleküle schwierig ist. Zur Optimierung aktueller ERT wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Leerzelllinie der Firma Glycotope modifiziert, um die Synthese von M6P zu verbessern. Die resultierende Zelllinie ermöglichte die rekombinante Expression von α-Galactosidase A (GAL) Molekülen, die einen bis zu 2-fach höheren M6P Anteil zeigten. In in vitro Experimente konnte nachgewiesen werden, dass die Aufnahme der hoch phosphorylierten GAL-Enzyme in Zielzellen verbessert war. Darüber hinaus wurde das Enzym GAL mittels „Protein-engineering“ so verändert, dass die hohen Verluste, die aufgrund der Aktivierung des Asialoglycoprotein- Rezeptors (ASGPR) in der Leber auftreten, verringert werden konnten. Das resultierende Fusionsenzym wies in vitro eine bis zu 20-fach reduzierte Bindung an den ASGPR auf. Zusätzlich konnte in vivo in Mäusen gezeigten werden, dass bis zu 30 % weniger Fusionsenzym in die Leber gelangte. Zuletzt wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Ansatz initiiert, der den Transport von rekombinanten Enzymen durch die BHS ermöglichen sollte. Die Moleküle, die im Rahmen dieses Experimentes erzeugt wurden, beruhen auf dem Prinzip der „Trojan-horse technology“, wobei ein rekombinantes Protein mittels „Protein-engineering“ so modifizier wird, dass es an einen Transzytose- Rezeptor bindet und so durch die BHS geschleust werden kann (z.B. Transferrinrezeptor). Mehrere Fusionsenzym-Varianten wurden rekombinant hergestellt, aufgereinigt und in vitro getestet. Es konnte gezeigt werden, dass mindestens ein Fusionsenzym an den Transferrinrezeptor bindet und somit möglicherweise durch rezeptorvermittelte Transzytose die BHS durchqueren könnte.
