Characterization of in vitro and in cellulo Tau protein aggregation by advanced light microscopy

Abstract

Neurodegenerative diseases (NDDs) encompass a heterogeneous group of chronic neurological disorders characterized by progressive neuron degeneration within specific regions of the central nervous system (CNS). Among these, Alzheimer's disease (AD) stands out as the most prevalent cause of dementia, accounting for approximately 60-80% of all dementia cases. Neuropathologically, AD is marked by the presence of two prominent protein pathological hallmarks: 1) the extracellular accumulation of aggregated amyloid-beta (Aβ) peptides, leading to the formation of amyloid-plaques, and 2) the intracellular aggregation of fibrillar structures composed of neuronal microtubule-associated protein Tau, forming neurofibrillary tangles (NFTs). Despite extensive and prolonged research efforts spanning several decades, the underlying molecular mechanisms of this intricate neurodegenerative condition remain only partially understood. In this context, the present study employs a well-established HEK sensor cell line, constitutively expressing the aggregation-prone mutant Tau repeat domain fused to either cyan fluorescent protein (CFP) or yellow fluorescent protein (YFP) (TauRDP301S-CFP/YFP). By introducing pre-aggregated Tau forms into these cells, a spectrum of distinct Tau assemblies is generated, encompassing large amorphous cytosolic aggregates (CYT) and amyloid-like structures (AMY), compact cytosolic Tau clusters (CLUS), Tau clusters near the nuclear envelope (NE), and nuclear spherical accumulations (NUC). After determining the sequence of accumulation type occurrence by live cell time-lapse imaging, I characterized the packing density of Tau in the different accumulation types using a multimodal microscopy approach. High-resolution FLIM/FRET microscopy, in which the fluorescent lifetime quenching of CFP serves as a proxy for the packing density of Tau, revealed distinct differences between Tau accumulations, as well as confirming a time-dependent hardening of Tau condensates in vitro. Optical diffraction tomography (ODT), which measures absolute protein concentration, revealed differences in the molecular and physical density of Tau accumulations. Additionally, it unveiled a drastic restructuring of 24-hour-old Tau 14 condensates compared to freshly formed 1-hour-old condensates, suggesting the potential transition from soluble Tau to fibrillar Tau aggregates. Lastly, 3D confocal reconstruction microscopy and StED microscopy provided insight into the precise positioning of different Tau accumulations regarding cytoskeletal fibers and cellular landmark organelles, such as the nuclear envelope and the endoplasmic reticulum (ER), revealing multiple interaction partners of Tau and implying possible downstream effects of Tau on cellular processes and mechanisms. By employing various light microscopy techniques, insights into Tau aggregation at different stages was gained, contributing to a deeper understanding of Tau aggregation formation and its implications for cellular processes. Furthermore, ODT emerged as a valuable tool for studying Tau aggregation in both cellular environments and in vitro conditions, revealing new structural insights. This research may offer prospects for understanding Tau transition and potential drug development.

Neurodegenerative Erkrankungen (NDDs) umfassen eine heterogene Gruppe chronischer neurologischer Störungen, die durch den progressiven Abbau von Neuronen in spezifischen Regionen des zentralen Nervensystems (ZNS) gekennzeichnet sind. Unter diesen ist die Alzheimer-Krankheit (AD) als häufigste Ursache von Demenz besonders hervorzuheben und macht etwa 60-80% aller Demenzfälle aus. Neuropathologisch ist die AD durch zwei prominente pathologische Proteine gekennzeichnet: 1) die extrazelluläre Ablagerung von aggregierten Amyloid-Beta (Aβ) -Peptiden, die zur Bildung von Amyloid-Plaques führen, und 2) die intrazelluläre Aggregation von faserförmigen Strukturen des neuronalen Mikro Tubulin-assoziierten Proteins Tau, die Neurofibrillenbündel (NFTs) bilden. Trotz umfangreicher und langjähriger Forschungsbemühungen über mehrere Jahrzehnte hinweg sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen dieses komplexen neurodegenerativen Zustands nur teilweise verstanden. In diesem Zusammenhang verwendet die vorliegende Studie eine etablierte HEKSensorzelllinie, die konstitutiv das aggregationsanfällige mutierte Tau- Tandemrepeats fusioniert mit entweder Cyanfluoreszenzprotein (CFP) oder Gelbfluoreszenzprotein (YFP) (TauRDP301S-CFP/YFP) exprimiert. Durch die Einführung voraggregierter Tau-Formen in diese Zellen entsteht eine Vielzahl von unterschiedlichen Tau-Assemblierungen, darunter große amorphe zytoplasmatische Aggregate (CYT) und Amyloid-ähnliche Strukturen (AMY), kompakte zytoplasmatische Tau-Cluster (CLUS), Tau-Cluster in der Nähe der Kernhülle (NE) und nukleäre kugelförmige Ansammlungen (NUC). Nachdem die Abfolge des Auftretens der Ansammlungstypen durch konfokale Echtzeitmikroskopie der Zellen ermittelt wurde, wurde die Packungsdichte von Tau in den verschiedenen Ansammlungstypen mithilfe eines multimodalen Mikroskopie- Ansatzes charakterisiert. Die hochauflösende FLIM/FRET-Mikroskopie, bei der die Fluoreszenzlebensdauer von CFP als Proxy für die Packungsdichte von Tau dient, 16 enthüllt deutliche Unterschiede zwischen den Tau-Akkumulationen und bestätigt gleichzeitig eine zeitabhängige Verfestigung der Tau-Kondensate in vitro. Die optische Beugungstomographie (ODT), die die absolute Protein-Konzentration misst, enthüllt Unterschiede in der molekularen und physischen Dichte der Tau- Akkumulationen. Außerdem deckt sie eine drastische Umstrukturierung der 24 Stunden alten Tau-Kondensate im Vergleich zu frisch gebildeten 1-Stunden alten Kondensaten auf, was auf den potenziellen Übergang von löslichem Tau zu faserförmigen Tau-Aggregaten hindeutet. Schließlich liefert 3DKonfokalrekonstruktionsmikroskopie und StED-Mikroskopie Einblicke in die genaue Positionierung verschiedener Tau-Akkumulationen in Bezug auf das Zytoskelett und zelluläre markante Organellen wie die Kernhülle und das endoplasmatische Retikulum (ER), wobei mehrere Interaktionspartner von Tau enthüllt werden und mögliche nachgeschaltete Auswirkungen von Tau auf zelluläre Prozesse und Mechanismen angedeutet werden. Durch den Einsatz verschiedener Lichtmikroskopie-Techniken kann ein Einblick in die Tau-Aggregation in verschiedenen Stadien gewonnen werden und so zu einem tieferen Verständnis der Bildung der Tau-Akkumulationen und ihrer Auswirkungen auf zelluläre Prozesse beitragen. Darüber hinaus erweist sich die ODT-Mikroskopie als wertvolles Instrument zur Untersuchung der Tau-Aggregation sowohl in zellulärer Umgebung als auch unter in vitro Bedingungen, und enthüllt neue strukturelle Erkenntnisse. Diese Forschung kann zukünftig zu einem besseren Verständnis des Übergangs von Tau führen und möglicherweise zur Entwicklung neuer Arzneimittel beitragen.