Vesicular glutamate transporters (VGLUTs) are essential for filling synaptic vesicles (SVs) with the neurotransmitter (NT) glutamate. After SV fusion and NT release, SVs are recycled to maintain a constant SV supply. In order for these SVs to participate again in neurotransmission, they must be refilled. Therefore, VGLUTs need to be efficiently and correctly targeted to SVs undergoing endocytosis. Previous studies showed that the C-terminal VGLUT1 FV motif, which is part of the dileucine-like sequence, is a sorting signal for VGLUT1 trafficking to SVs. Mutations in the FV motif show slower VGLUT1 recycling (Foss et al., 2013; Voglmaier et al., 2006), but it is unknown, whether an impaired VGLUT1 retrieval consequently alters glutamatergic neurotransmission. This issue was addressed by further studying mutant variants of this VGLUT1 C-terminal dileucine-like motif sequence. Another aim of the present study was to investigate software predicted putative VGLUT1 C-terminus serine phosphorylation sites to understand their potential role for the VGLUT1 physiology and SV cycling. Additionally, the functional consequences of an entire VGLUT1 C-terminus deletion were studied as well. Therefore, VGLUT1 C-terminal mutants were expressed by lentivirus in autaptic hippocampal VGLUT1 knockout (KO) neurons and compared to a rescue of the KO neurons with expression of the VGLUT1 wildtype (WT) protein. Parameters of release and SV recycling were assessed using whole-cell voltage clamp recordings in combination with pHluorin-based imaging. With high resolution electron microscopy (EM) further information were obtained especially about SV morphology and SV number per synapse, which might be altered according to changes in vesicular release or recycling properties. Thereby, it was found out that neurons expressing a full VGLUT1 C-terminus truncation construct (VGLUT1∆496-560), where all amino acids immediately following the last 12th transmembrane domain are deleted, are not functional. Those neurons exhibit an electrophysiological and morphological VGLUT1 KO-like phenotype apparent in significantly reduced postsynaptic responses and deformed, smaller SVs compared to WT rescued neurons indicating that the SVs of VGLUT1∆496-560 are not glutamate filled. A reason for the impairments of VGLUT1∆496-560 may be protein mislocalization to vesicles. However, no crystal structure of the VGLUT1 protein exists and it is unclear, whether this deletion may have been within or close enough to the transmembrane domain causing instability of the protein and subsequent degradation. In contrast, neurons expressing a C-terminus truncation construct that was a few amino acids shorter (VGLUT1∆504-560), including a WAEPE motif sequence, can rescue the VGLUT1 KO- like phenotype to WT rescue levels, suggesting that the main function of the transporter to fill SVs with NT is here not affected. Moreover, it could be also shown that the SV morphology is unaltered in the VGLUT1∆504-560 mutant. However, the VGLUT1 recycling of VGLUT1∆504-560 is substantially slower compared to WT rescue levels. Interestingly, additional experiments with synaptophysin-pHluorin show no significant changes in the general SV recycling when the shorter VGLUT1 C-terminus truncation mutant (VGLUT1∆504-560) is present on vesicles. Furthermore, dileucine-like motif sequence mutants, which show also a slower VGLUT1 recycling, reveal no effects on neurotransmission as well. These results suggest that the entire VGLUT1 C-terminus, but in particular the dileucine-like motif sequence, are mainly essential for VGLUT1 recycling, but the speed of VGLUT1 recycling is not a limiting factor for maintaining baseline synaptic transmission. Furthermore, it was discovered that a VGLUT1 mutant with one phosphodeficient mutation in a putative serine phosphorylation site, shows higher NT release, which might indicate a modulatory role in VGLUT1 function.
Vesikuläre Glutamattransporter (VGLUTs) sind essenziell für die Befüllung synaptischer Vesikel (SV) mit dem Neurotransmitter (NT) Glutamat. Zur Aufrechterhaltung einer konstanten Vesikelbereitstellung nach ihrer Fusion mit der Plasmamambran und NT Freisetzung in den synaptischen Spalt werden die SV recycelt. Damit die SV erneut in der Neurotransmission mitwirken können, müssen sie wieder mit Glutamate befüllt werden. Dafür müssen VGLUTs während der Endozytose effizient und zielgerichtet zu den Vesikeln transportiert werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass das C-terminale VGLUT1 FV Motiv, welches Teil einer Di-Leucin-ähnlichen Sequenz ist, eine Signalsequenz für den Transport von VGLUT1 zu den SV darstellt und das Mutationen im FV Motiv zu einem verlangsamtem VGLUT1 Recycling führen (Foss et al., 2013; Voglmaier et al., 2006). Jedoch ist bislang nicht bekannt, ob in Folge eines beeinträchtigen VGLUT1 Recyclings die glutamaterge Neurotransmission verändert wird. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Funktion des VGLUT1 C-terminalen Di-Leucin-ähnlichen Sequenzmotivs weiter zu charakterisieren. Hierfür wurden verschiedene durch zielgerichtete Mutagenese hergestellte Konstrukte des VGLUT1 C-Terminus untersucht. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung Computersoftware-basierter vermeintlicher Serin Phosphorylierungsstellen des VGLUT1 C-Terminus zur Klärung ihrer potenziellen Rolle für die VGLUT1 Physiologie und den Vesikelzyklus. Darüber hinaus wurden auch die funktionellen Konsequenzen einer kompletten Deletierung des VGLUT1 C-Terminus untersucht. Dabei wurde herausgefunden, dass Neurone die ein vollständig verkürztes VGLUT1 C-Terminus Konstrukt (VGLUT1∆496-560) exprimieren, bei dem alle Aminsosäuren direkt nach der letzten 12ten Transmembrandomäne entfernt wurden, nicht funktionell sind. Diese Neurone weisen im Vergleich zu Wildtyp (WT) Neuronen einen VGLUT1 Knockout (KO)-ähnlichen Phänotyp mit signifikant reduzierten postsynaptischen Antworten und deformiert aussehenden, kleineren SV auf. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Vesikel der VGLUT1∆496-560 Mutante nicht mit Glutamat befüllt sind. Eine mögliche Ursache dieser Veränderungen der VGLUT1∆496-560 Mutante könnte eine Misslokalisation des Proteins zu den SV sein. Allerdings gibt es bisher keine Kristallstruktur vom VGLUT1 Protein, welche belegen könnte ob diese Deletion in der Nähe der letzten Transmembrandomäne der Grund für ein möglicherweise instabiles Protein und in Folge dessen einer Degradation darstellt. Im Gegensatz dazu können Neurone, die ein weniger kurzes C-terminales Konstrukt (VGLUT1∆504-560) exprimieren, welches eine WAEPE Motivsequenz einschließt, den KO-ähnlichen Pänotyp wieder auf WT-Niveau herstellen. Dieses Ergebnis zeigt, dass bei VGLUT1∆504-560 Mutanten die Funktion des Transporters die SV mit NT zu füllen nicht beeinträchtigt ist. Dies spiegelt sich auch in der unveränderten Morphologie der Vesikel der VGLUT1∆504-560 Mutante wieder. Allerdings ist das VGLUT1 Recycling in der VGLUT1∆504-560 Mutante im Vergleich zum WT drastisch verlangsamt. Interessanterweise zeigen zusätzliche Experimente, dass der grundlegende Vesikelzyklus durch diese Mutation keine signifikanten Beeinträchtigungen aufweist. Mutationen in der Di-Leucin-ähnlichen Motivsequenz, welche genauso ein verzögertes VGLUT1 Recycling aufweisen, zeigen ebenfalls keine Effekte in der Neurotransmission. Zusammengefasst zeigen die Ergebisse dieser Arbeit, dass der gesamte VGLUT1 C-Terminus, insbesondere das Di-Leucin-ähnliche Sequenzmotiv, hauptverantwortlich für das VGLUT1 Recycling ist. Dabei scheint die Geschwindigkeit des VGLUT1 Recyclings keinen limitierenden Faktor für die Erhaltung der grundlegenden synaptischen Transmission darzustellen. Darüber hinaus kann in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Mutation einer putativen Serin-Phosphorylierungsstelle, welche eine permanent Dephosphorylierung mimt, die NT Freisetzung erhöht. Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass Phosphorylierung von VGLUT1 dessen Funktion beeinflusst.
