Functional Polymer Gels by Click- and Supramolecular Chemistry

Abstract

In this thesis, a modular construction kit for supramolecular polymer gels has been prepared by use of linear chains of electrophilic methacryl-succinimidyl (MASI) modified poly(N-isopropylacrylamide). The MASI units were replaced by nucleophilic substitution with amine-functionalized derivatives of supramolecular crosslinkable motifs. By this means, a set of pNIPAAm polymers that consist of exactly the same polymer backbone functionalized with different types of supramolecular crosslinkable side groups has been synthesized. Since the pNIPAAm is soluble in a variety of solvents, gels can be prepared and studied at various solvent conditions. Polymer chain crosslinking is achieved via hydrogen bonding or metal complexation by addition of low molecular weight crosslinkers that are complementary to the motifs on the polymer. In all cases, the mechanical properties of the resulting supramolecular gels are determined by the strength of supramolecular association, as revealed quantitatively by oscillatory shear rheology and isothermal titration calorimetry. By this means, supramolecular networks of greatly varying mechanical strength, from low viscous liquids to highly elastic gels, could be prepared. Additionally, the present toolkit allows further functionalization of the precursors with amine-functionalized fluorescent markers to probe the polymer networks by fluorescence-based imaging or tracking techniques. We followed this approach and studied these supramolecular networks by probing the micrometer-scale mobility of fluorescently tagged linear chains that diffuse through them. As a result, at a certain threshold strength of association the concentration dependence of the tracer-chain diffusivity is in agreement with theoretical predictions derived from the ‘sticky reptation’ model by Rubinstein and Semenov. Although our investigations demonstrated the utility of our modular toolkit, they also revealed a persistent limitation: complex long-term relaxation is observed that cannot be clearly related to theoretical modeling. We attributed this finding to irregular and inhomogeneous network structure caused by the polydispersity of both the precursor chain molecular weight and the side group substitution pattern. As a consequence, we developed a material toolkit to form supramolecular polymer networks with different crosslinking strengths that have the potential to exhibit close to regular and determined nanometer- scale network topologies. For this purpose, narrowly distributed tetra-arm poly(ethylene glycol) precursors were end-capped with terpyridine moieties. Different transition metal ions such as Mn2+, Zn2+, and Co2+ were used to form transient networks with different strengths of connectivity in a variety of different solvents. Since the polymer network mesh size is determined by the molecular weight of the arms of the precursor chains and since this molecular weight is regular and narrowly disperse, networks of highly regular topology can be obtained, as determined by static light scattering. As hydrogel-based drug depots for biomedical applications, we developed pharmacologically responsive supramolecular biohybrid microgels. For this purpose, a generically applicable method for the synthesis of micrometer-scale, injection-ready biohybrid materials was devised. Droplet-based microfluidics was used to generate monodisperse pre-microgel fluid droplets, wherein which fluorescein- modified 8-arm PEG was reacted with a thiol-functionalized humanized anti- fluorescein single chain antibody fragment and vinylsulfone-functionalized 8-arm PEG. This resulted in the formation of stable, narrowly dispersed supramolecular microgels of 30 and 150 µm in diameter. The addition of free fluorescein to these microgels induced a weakening of their hydrogel structure, eventually leading to its disintegration. For the encapsulation of living cells into reversibly crosslinked microgel particles, again, droplet- based microfluidics and supramolecular gelation have been combined. Linear PEG precursor polymers that carry bipyridine moieties on both chain termini were gelled by complexation to iron(II) ions. By using PEG precursors of different molecular weights at different concentrations the microgel elasticity can be controlled and thereby the cell viabilities have been optimized to exceed 90%. The microgels are degradable by addition of competitive ligands within 1.5 h under very mild conditions, with no effect on the viability of the encapsulated and released cells. Although this approach is an important step toward a new platform for storing, studying, and manipulating cells within artificial extracellular matrixes and releasing them subsequently, it is not suitable for long-term applications due to microgel auto-degradation within timespans of just several hours. A strategy to overcome this limitation is to increase the density of reversibly associating groups, along with increasing the extent of chain entanglement; both require polymer side-group functionalization rather than polymer end-group functionalization. Thus, we developed a supramolecular polymer toolkit based on biocompatible linear polyglycerol that is functionalized with orthogonal supramolecular crosslinkable side groups. Strain-promoted azide−alkyne cycloaddition was employed to functionalize the polymer backbone with cyanurate and diaminotriazine moieties that form a multipoint hydrogen-bonded array, along with terpyridine moieties that form bivalent metal complexes with iron(II) ions. By this type of orthogonal crosslinking, supramolecular hydrogels can be formed at mild conditions that remain stable for several weeks. The orthogonal reversibility of the crosslinks allows the hydrogels to be selectively de- crosslinked by orthogonal stimulation. Whereas addition of metal chelators has no impact on the hydrogen-bonding crosslinking in these systems, it reverses the metal-complexation crosslinking. Conversely, addition of acetic acid reverses the hydrogen bonding, but has no influence on the metal complexation. Their responsiveness and reversibility along with the biocompatibility of the lPG backbone polymer render this class of hydrogels promising for use in temporary cell encapsulation and controlled cell release in future work. As an alternative to supramolecular crosslinking to generate stimuli-responsive cell-laden microgels, we employed covalent crosslinking along with incorporation of degradable linkers into the polymer network. We combined droplet microfluidic templating with bio-orthogonal thiol−ene click chemistry to fabricate monodisperse, cell-laden microgel particles in which the encapsulated mammalian cells exhibit excellent viabilities of up to 90%. In this approach, micro-droplet gelation is achieved via the nucleophilic Michael addition of dithiolated PEG macro-crosslinkers to acrylated hPG building blocks. By systematic variation of the microgel mechanical properties, their influence on the viability and proliferation of encapsulated cells has been probed. Degradation of the microgel particles through hydrolysis of the ester bond close to the thioether bond has been observed over a time of several weeks, but has not been precisely controllable or tunable. To overcome this limitation we designed a new microgel construction kit for the bioorthogonal encapsulation of living cells using strain-promoted azide–alkyne cycloaddition for crosslinking along with acid-labile benzacetal linkers for the programmed cell release. The variation of the substitution pattern of the benzacetals allows precise control of the microgel degradation kinetics in the interesting pH range between 4.5 and 7.4. The encapsulated cells could be cultured inside the microgels with full retention of their viability and the subsequent microgel degradation had no detrimental effect on the encapsulated and released cells. Besides temporary cell encapsulation, this construction kit has potential for the stabilization and controlled release of many other therapeutic relevant biological systems such as proteins, genes, and even bacteria.

In dieser Arbeit wurde ein modulares Baukastensystem für die Herstellung von supramolekularen Polymergelen entwickelt. Dazu wurde zunächst lineares Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAAm) hergestellt, das elektrophile Methacryl- Succinimidyl-Einheiten (MASI) enthielt. Diese MASI-Einheiten konnten dann durch nukleophile Substitution mit Amin-funktionalisierten Derivaten supramolekular vernetzbarer Motive umgesetzt werden. Auf diese Weise konnte ein Satz von Polymeren hergestellt werden, die aus ein und demselben Rückgrat bestehen, aber unterschiedliche Typen supramolekular vernetzbarer Seitengruppen enthalten. Da PNIPAAm in einer Vielzahl von verschiedenen Lösungsmitteln löslich ist, konnten auch die entsprechenden supramolekularen Netzwerke in verschieden Lösungsmitteln hergestellt und untersucht werden. Die Polymerketten wurden über Wasserstoffbrückenbindungen oder Metallkomplexierung vernetzt, indem niedermolekulare Vernetzer hinzugegeben wurden, die komplementär zu den supramolekularen Motiven des Polymers sind. In allen untersuchten Fällen werden die mechanischen Eigenschaften der supramolekularen Netzwerke durch die Stärke der supramolekularen Wechselwirkung bestimmt, was quantitativ mittels oszillatorischer Scherrheologie und isothermaler Titrationskalorimetrie gezeigt werden konnte. Auf diese Weise konnten supramolekulare Netzwerke stark unterschiedlicher mechanischer Stärke, von niedrig viskosen Flüssigkeiten bis hin zu hoch elastischen Gelen, hergestellt werden. Darüber hinaus erlaubt der vorliegende Materialbaukasten die Funktionalisierung der Polymere mit Amin-funktionalisierten fluoreszierenden Markern, um die Polymernetzwerke mittels fluoreszenzbasierten Bildgebungsverfahren untersuchen zu können. Wir haben diesen Ansatz verfolgt und die Mobilität von fluoreszenzmarkierten linearen Ketten in den supramolekularen Polymernetzwerken untersucht. Ab einer bestimmten Bindungsstärke der supramolekularen Motive verhielt sich die Konzentrationsabhängigkeit der Kettendiffusivität in Übereinstimmung mit theoretischen Vorhersagen des ‚sticky reptation‘ Modells von Rubinstein und Semenov. Wenngleich all diese Untersuchungen die Nützlichkeit unseres modularen Baukastensystems gezeigt haben, wurden gleichzeitig auch seine Grenzen aufgedeckt: Eine komplexe Langzeit-Relaxation wurde beobachtet, die nicht eindeutig mit theoretischen Modellen beschrieben werden kann. Wir haben diese Beobachtung auf eine uneinheitliche und inhomogene Netzwerkstruktur zurückgeführt, die sowohl von der Polydispersität der Vorläuferpolymere als auch von deren uneinheitlicher Seitengruppenvernetzung verursacht wird. Als Konsequenz hieraus haben wir ein weiteres Baukastensystem entwickelt, mit dem man wiederum supramolekulare Polymernetzwerke unterschiedlicher Stärke erzeugen kann, die jedoch eine einheitliche und definierte nanometerskalige Netzwerktopologie aufweisen. Hierfür wurden engverteilte Vierarm- Poly(ethylenglykol)-Vorläufer an ihren Kettenenden mit Terpyridin-Motiven funktionalisiert. Unterschiedliche Übergangsmetallionen wie Mn2+, Zn2+, und Co2+ wurden benutzt, um supramolekulare Netzwerke unterschiedlicher Vernetzungsstärke in verschiedenen Lösungsmitteln herzustellen. Da die Maschenweite der Polymernetzwerke durch das Molekulargewicht der Arme der Vorläuferpolymere bestimmt wird und da dieses Molekulargewicht einheitlich und engverteilt ist, können extrem homogene Netzwerke erhalten werden, wie mittels statischer Lichtstreuung gezeigt werden konnte. Als hydrogelbasierte Wirkstoffdepots für biomedizinische Anwendungen haben wir pharmakologisch- responsive supramolekulare Biohybrid-Mikrogele hergestellt. Dazu wurde eine generell einsetzbare Methode für die Herstellung von mikrometerskaligen, injizierbaren Biohybridmikrogelen entwickelt. Tröpfchenbasierte Mikrofluidik wurde benutzt, um monodisperse Tröpfchen herzustellen, in denen fluorescein- modifiziertes Achtarm-PEG mit einem Thiol-funktionalisierten humanisierten Anti-Fluorescein scFv-Fragment und Vinylsulfon-funktionalisiertem Achtarm-PEG reagierten. Als Folge wurden stabile, engverteilte supramolekulare Mikrogele von 30 und 150 µm Durchmesser erhalten. Die Zugabe von freiem Fluorescein zu diesen Mikrogelen führte zur Schwächung ihrer Hydrogelstruktur bzw. schließlich zu deren Auflösung. Für die Verkapselung von lebenden Zellen in reversibel vernetzte Mikrogelpartikel wurden die tröpfchenbasierte Mikrofluidik und die supramolekulare Vernetzungschemie wiederum miteinander kombiniert. Lineare PEG Vorläuferpolymere wurden an ihren beiden Kettenenden mit Bipyridinen funktionalisiert und durch Komplexierung mit Eisen(II)-ionen zu Mikrogelen vernetzt. Durch Wahl von PEG-Polymeren unterschiedlichen Molekulargewichts bei unterschiedlichen Polymerkonzentrationen konnte die Mikrogelelastizität eingestellt werden. Dadurch gelang es, die Mikrogeleigenschaften für die Zellverkapselung zu optimieren und Zellvitabilitäten von über 90% zu erreichen. Die erhaltenen Mikrogele können durch Zugabe von kompetitiven Liganden innerhalb von 1,5 Stunden unter milden Bedingungen aufgelöst werden. Der Abbauprozess der Partikel hat keine schädlichen Auswirkungen auf die Zellvitabilität der verkapselten und freigesetzten Zellen. Dieser Ansatz ist ein wichtiger Schritt hin zu einer neuen Materialplattform, die es erlaubt, Zellen in einer künstlichen extrazellulären Matrix zu verkapseln, zu untersuchen, zu manipulieren und anschließend wieder freizusetzen. Allerdings ist der vorliegende Ansatz nicht für Langzeitanwendungen geeignet, da die Mikrogele innerhalb mehrerer Stunden durch Autoabbau aufgelöst werden. Diese Einschränkung könnte überwunden werden, indem die Dichte vernetzbarer Gruppen erhöht und die Kettenverschlaufung verstärkt wird. Hierzu müssten die polymeren Vorläufer in ihren Seitenketten funktionalisiert werden und nicht nur an ihren Enden. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde lineares Polyglycerol synthetisiert und an den Seitenketten mit orthogonal vernetzbaren supramolekularen Motiven funktionalisiert. Die spannungsvermittelte Azid–Alkin Zykloaddition wurde verwendet, um das Polymer einerseits mit Cyanurat- und Diaminotriazin- Einheiten zu funktionalisieren, die zusammen eine komplexe Anordnung von Wasserstoffbrücken ausbilden, und andererseits mit Terpyridin-Einheiten, die bivalente Metallkomplexe mit Eisen(II)-ionen eingehen. Diese Art der orthogonalen Vernetzung ermöglicht die Bildung von supramolekularen Hydrogelen unter milden Bedingungen, wobei die erhaltenen Gele über eine exzellente Langzeitstabilität von mehreren Wochen verfügen. Gleichzeitig ermöglicht die orthogonale Reversibilität der Netzknoten die Hydrogele durch orthogonale Stimulierung selektiv zu entnetzen. Die Zugabe von Metall-Chelatoren hat keinen Einfluss auf die Wasserstoffbrückenvernetzung, jedoch führt sie zur Auflösung der Metall-komplexierten Vernetzung. Umgekehrt führt die Zugabe von Essigsäure zur Auflösung der Wasserstoffbrückenbindungen, ohne einen Einfluss auf die Metallkomplexierung zu haben. Ihre Responsivität und Reversibilität, vereint mit der Biokompatibilität von linearem Polyglycerol, machen diese Hydrogele vielversprechend für die zukünftige Verwendung in der temporären Zellverkapselung und der kontrollierten Zellfreisetzung. Als Alternative der supramolekularen Vernetzung zur Herstellung von stimuli-responsiven zellbeladenen Mikrogelen haben wir die kovalente Vernetzung in Kombination mit abbaubaren Linkern verwendet. Hierzu wurde die tröpfchenbasierte Mikrofluidik mit bioorthogonaler Thiol–En Click-Chemie gekoppelt und es konnten mit Säugetierzellen beladene Mikrogele hergestellt werden, in denen die verkapselten Zellen exzellente Überlebensraten von über 90% aufwiesen. In diesem Ansatz wird die Tröpfchengelierung durch die nukleophile Michael- Addition von PEG-dithiol- Makromonomeren und acrylierten hPG-Bausteinen erreicht. Durch systematische Variation der mechanischen Eigenschaften der Mikrogelpartikel wurde ihr Einfluss auf die Zellvitabilität und die Zellvermehrung untersucht. Desweiteren wurde ein Abbau der Mikrogelpartikel aufgrund der Hydrolyse der Esterbindung nahe der Thioetherbindung in einem Zeitraum von einigen Wochen beobachtet. Allerdings konnte dieser Abbau nicht präzise gesteuert und eingestellt werden. Zur Überwindung dieser Einschränkung haben wir einen neuartigen Mikrogelbaukasten entwickelt, mit dem lebende Zellen durch Vernetzung mit der spannungsvermittelten Azid–Alkin Zykloaddition verkapselt und durch säurelabile Benzacetallinker im Polymernetzwerk wieder freigesetzt werden können. Durch Änderung des Substitutionsmusters der Benzacetale kann die Kinetik des Mikrogelabbaus im interessanten pH-Bereich von 4,5 bis 7,4 exakt gesteuert werden. Die verkapselten Zellen können in den Mikrogelen unter vollständiger Aufrechterhaltung ihrer Vitabilität kultiviert werden und auch der darauffolgende Mikrogelabbau hat keine negativen Auswirkungen auf die verkapselten und freigesetzten Zellen. Neben der temporären Zellverkapselung hat dieser Mikrogelbaukasten das Potential für die Stabilisierung und kontrollierte Freisetzung vieler anderer therapeutisch wichtiger biologischer Systeme, wie z. B von Proteinen, Genen und sogar Bakterien.