Autoantibodies against the endothelin type A receptor (ETAR) (ETAR-AAbs), a G protein-coupled receptor, are recognizable players in vasculopathies, especially systemic sclerosis. Activation of ETAR by its natural ligand, endothelin-1 (ET-1) can be pathogenic. In this case, similar clinical features as in ETAR-AAbs activation are observed. However, the binding domain of both ligands is unknown. Given the accessibility and uniqueness of the extracellular amino terminus of ETAR (ETAR-Nter), it was hypothesized that both ligands activate different domains of ETAR-Nter to trigger distinct signaling dynamics. Therefore, the role of ETAR-Nter in modulating differences in ET-1 and an ETAR-AAbs-mediated signaling mechanism in a human embryonic kidney cell line was investigated. Three different parts of ETAR-Nter were sequentially deleted by site-directed mutagenesis namely, amino acid (AA) 46-65, 26-65, and 2-65. The relative membrane expression of ETAR was determined using the NanoGlo® HiBiT extracellular detection assay. Transfected cells with or without a luciferase reporter were independently stimulated with different doses of ET-1 and ETAR-AAbs to determine their respective effect on G-proteins and extracellular signal-regulated protein kinase 1/2 (ERK 1/2) activation. The effect of ETAR-Nter on ETAR-AAbs-mediated cyclic adenosine monophosphate (cAMP) production was also assessed using enzyme-linked immunosorbent assay. ETAR-AAbs and ET-1 activated Gq/11, G12/13 and ERK 1/2, but ETAR-AAbs induced a stronger production of cAMP than ET-1. The loss of AA 2-25 increased relative membrane expression of ETAR but decreased ET-1 and ETAR-AAbs-mediated intracellular activation. Loss of AA 46-65 and 26-45 had no effect on ligand-mediated activation of Gq/11 and ERK 1/2. Rather, ET-1 induced G12/13 activation via AA 26-45, while ETAR-AAbs affected Gq/11 and G12/13 activation via AA 2-25 and 46-65 respectively. ETAR-AAbs also reduced cAMP levels due to AA 26-45. This shows that ETAR-AAbs are agonistic but different parts of ETAR-Nter influence signaling selectivity. The results demonstrate the need for structural modeling of antibody-ETAR to identify binding domains useful for drug selectivity in ETAR-AAbs-mediated vasculopathies such as systemic sclerosis.
Autoantikörper gegen den Endothelin-Typ-A-Rezeptor (ETAR) (ETAR-AAbs), einen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, spielen bei Vaskulopathien, insbesondere bei systemischer Sklerose, eine erkennbare Rolle. Die Aktivierung von ETAR durch seinen natürlichen Liganden, Endothelin-1 (ET-1), kann pathogen sein. In diesem Fall werden ähnliche klinische Merkmale wie bei der Aktivierung von ETAR-AAbs beobachtet. Der Bindungsbereich beider Liganden ist jedoch unbekannt. Angesichts der Zugänglichkeit und Einzigartigkeit des extrazellulären Aminoterminus von ETAR (ETAR-Nter) wurde die Hypothese aufgestellt, dass beide Liganden unterschiedliche Domänen von ETAR-Nter aktivieren, um unterschiedliche Signaldynamiken auszulösen. Daher wurde die Rolle von ETAR-Nter bei der Modulation von Unterschieden in ET-1 und einem ETAR-AAbs-vermittelten Signalmechanismus in einer menschlichen embryonalen Nierenzelllinie untersucht. Drei verschiedene Teile von ETAR-Nter wurden nacheinander durch ortsgerichtete Mutagenese entfernt, nämlich die Aminosäuren (AA) 46-65, 26-65 und 2-65. Die relative Membranexpression von ETAR wurde mit dem extrazellulären NanoGlo® HiBiT-Nachweisassay bestimmt. Transfizierte Zellen mit oder ohne Luciferase-Reporter wurden unabhängig voneinander mit verschiedenen Dosen von ET-1 und ETAR-AAbs stimuliert, um ihre jeweilige Wirkung auf G-Proteine und die Aktivierung der extrazellulären signalgesteuerten Proteinkinase 1/2 (ERK 1/2) zu bestimmen. Die Wirkung von ETAR-Nter auf die durch ETAR-AAbs vermittelte Produktion von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) wurde ebenfalls mit einem Enzymimmunoassay untersucht. ETAR-AAbs und ET-1 aktivierten Gq/11, G12/13 und ERK 1/2, aber ETAR-AAbs induzierte eine stärkere Produktion von cAMP als ET-1. Der Verlust von AA 2-25 erhöhte die relative Membranexpression von ETAR, verringerte jedoch die ET-1- und ETAR-AAbs-vermittelte intrazelluläre Aktivierung. Der Verlust der AA 46-65 und 26-45 hatte keine Auswirkung auf die Liganden-vermittelte Aktivierung von Gq/11 und ERK 1/2. Vielmehr induzierte ET-1 die G12/13-Aktivierung über AA 26-45, während ETAR-AAbs die Gq/11- und G12/13-Aktivierung über AA 2-25 bzw. 46-65 beeinflussten. ETAR-AAbs verringerten auch den cAMP-Spiegel durch AA 26-45. Dies zeigt, dass ETAR-AAbs agonistisch sind, aber verschiedene Teile von ETAR-Nter die Signalselektivität beeinflussen. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Strukturmodellierung von Antikörper-ETAR notwendig ist, um Bindungsbereiche zu identifizieren, die für die Arzneimittelselektivität bei ETAR-AAbs-vermittelten Vaskulopathien wie der systemischen Sklerose nützlich sind.
