Untersuchungen zur Reaktionsspezifität von ALOX15-Orthologen niederer Vertebraten

Abstract

Einleitung: Arachidonsäurelipoxygenasen (ALOX-Isoformen) sind Dioxygenasen, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren zu den entsprechenden Hydroperoxyfettsäurederivaten oxygenieren. Im humanen Genom gibt es sechs funktionelle ALOX-Gene (ALOX15, ALOX15B, ALOX12, ALOX12B, ALOXE3, ALOX5), die für funktionell unterschiedliche Isoenzyme kodieren. Die Reaktionsspezifität von ALOX15-Orthologen vieler höherer Vertebraten (Säugetiere) ist gut charakterisiert, wohingegen es nur wenige Daten über das Vorhandensein von ALOX-Isoformen bei Knochenfischen gibt. Auch wurde bislang nicht untersucht, ob der oxidative Lipidstoffwechsel in kausaler Beziehung zur beschleunigten Alterung von N. furzeri, einem beliebten Modellorganismus in der Altersforschung, steht. Hieraus ergaben sich für die vorliegende Arbeit folgende konkrete Fragestellungen: i) Kommen ALOX-Gene in Knochenfischen weit verbreitet vor und können hier echte ALOX15-Gene nachgewiesen werden? ii) Können Knochenfisch ALOX-Isoformen rekombinant exprimiert werden und unterscheiden sich ihre katalytischen Eigenschaften von denen höherer Wirbeltiere? iii) Folgen die Knochenfisch ALOX-Isoformen den Hypothesen, die zur Erklärung der Reaktionsspezifität anderer ALOX-Isoformen entwickelt wurden? iv) Lassen sich aus dem ALOX-Stoffwechsel von N. furzeri Schlussfolgerungen zum Mechanismus der beschleunigten Alterung dieser Tiere ableiten? Methodik: Zur Beantwortung dieser Fragen wurden ausgewählte ALOX-Isoformen verschiedener Knochenfische als rekombinante N-terminale His-tag Fusionsproteine in pro- und eukaryotischen Expressionssystemen exprimiert und hinsichtlich ihrer protein-chemischen und enzymatischen Eigenschaften charakterisiert. Ergebnisse: ALOX-Gene kommen in den Genomen von Knochenfischen weit verbreitet vor, wobei jedoch keines der kodierten Enzyme zweifelsfrei als ALOX15-Ortholog identifiziert werden konnte. Die Knochenfisch ALOX-Isoformen konnten rekombinant exprimiert werden, wobei sich ihre katalytischen Eigenschaften teilweise von denen höherer Wirbeltiere unterschieden. Die Knochenfisch ALOX-Isoformen folgen weder vollumfänglich dem Triadenkonzept der ALOX15-Orthologen noch der A-vs.-G-Hypothese der Stereospezifität. Im Rahmen dieser Arbeit konnte der Zusammenhang zwischen dem ALOX-Stoffwechsel von N. furzeri und der beschleunigten Alterung dieser Knochenfischspezies nicht abschließend geklärt werden. Schlussfolgerung: ALOX-Isoformen kommen bei Knochenfischen weit verbreitet vor, jedoch stimmen die durch die Datenbanken vorgenommenen Annotierungen nicht immer mit den in vitro Untersuchungen zur Reaktionsspezifität überein. Die Beobachtung, dass die von uns untersuchten Knochenfisch ALOX-Isoformen nicht dem Triadenkonzept folgen, welches auf alle bisher identifizierten Säugetier ALOX15-Orthologen anwendbar ist, spricht dafür, dass es sich bei diesen Proteinen eher nicht um Funktionsäquivalente der Säugetier ALOX15-Orthologen handelt.

Introduction: Arachidonate lipoxygenases (ALOX isoforms) are dioxygenases which catalyse the oxygenation of polyunsaturated fatty acids to the corresponding hydroperoxy derivatives. The human genome involves six functional ALOX genes (ALOX15, ALOX15B, ALOX12, ALOX12B, ALOXE3, ALOX5), which encode for functional distinct isozymes. The reaction specificity of ALOX15 orthologs of higher vertebrates such as mammals has been well characterized. In contrast, little is known about the presence of ALOX isoforms in bony fish. Moreover, it has not yet been explored whether there is a causal relationship between the oxidative lipid metabolism and the accelerated aging process of N. furzeri, which is a popular model organism in age research. This lack of knowledge resulted in the following specific questions for the present dissertation: i) Are ALOX genes widely distributed in bony fish and can true ALOX15 genes be detected in these vertebrates? ii) Is it possible to express bony fish ALOX isoforms as functional recombinant proteins and do their catalytic properties differ from those of higher vertebrates? iii) Do the bony fish ALOX isoforms follow the existing hypotheses which explain the reaction specificity of other ALOX isoforms? iv) Is the ALOX metabolism of N. furzeri related to accelerated aging of this bony fish species? Methodology: To answer these questions, selected bony fish ALOX isoforms were expressed as recombinant N-terminal his-tag fusion proteins in pro- and eucaryotic expression systems and they were characterized in respect to their protein-chemical and catalytic properties. Results: ALOX genes occur frequently in different bony fish species. We expressed putative ALOX15 orthologs of three different bony fish species as catalytically active recombinant N-terminal his-tag fusion proteins but neither of the characterized enzymes exhibited a high degree of functional similarity with mammalian ALOX15 orthologs despite their database annotation as ALOX15. The putative bony fish ALOX15 orthologs did neither follow the Triad Concept of reaction specificity of ALOX15 orthologs nor the A-vs.-G-Hypothesis of stereospecificity. Comparison of the functional characteristics of the three putative bony fish ALOX15 orthologs did not provide any evidence for the assumption that the enzyme of N. furzeri is involved in the accelerated aging process of this bony fish species. Conclusions: ALOX genes occur frequently in bony fish genomes, but the functional characteristics of the putative bony fish ALOX15 orthologs are clearly different from those of mammalian ALOX15 isoforms. Our observation, that the putative bony fish ALOX15 orthologs do not follow the Triad Concept which is applicable for all mammalian ALOX15 orthologs tested so far strongly suggests that these enzymes may not be considered functional equivalents of mammalian ALOX15 orthologs in bony fish.